Estudio y caracterización funcional de la interacción de la E3 ligasa CRL4Cdt2 con el complejo regulador de la cromatina G9a GLP

La formación y progresión de tumores está regulada en última instancia por la abundancia y la actividad de factores proteicos oncogénicos o supresores tumorales. En línea con esto se ha demostrado que la proteólisis irregular de factores proteicos implicados en la regulación del ciclo celular, la transcripción génica y la apoptosis contribuye a la transformación oncogénica y a la carcinogénesis. En células eucariotas, la homeostasis proteica está finamente regulada por el Sistema Ubiquitina/Proteosoma (Ubiquitin Proteasome System, UPS), que consiste en una compleja red enzimática encargada de transferir moléculas de ubiquitina a un sustrato y de este modo promover su degradación a través del proteosoma o modular su ubicación espacio temporal en una vía celular determinada. Por lo tanto, el estudio a nivel molecular de la cascada de ubiquitinación, junto con el desarrollo de compuestos que modulan componentes específicos del UPS, podrían facilitar el desarrollo y mejoramiento de nuevos y mejores tratamientos de distintas patologías. En este sentido, las ligasas de ubiquitina (o E3s) son excelentes candidatas debido a que estas enzimas son los efectores finales de la cascada de ubiquitinación y dictan la especificidad de la maquinaria del UPS. La E3 ligasa CRL4Cdt2 desempeña un rol fundamental en la regulación de la replicación y reparación del ADN, en condiciones normales como así también en respuesta al daño al ADN. Diferentes evidencias indican que las alteraciones en los niveles de CRL4Cdt2 pueden contribuir a la aparición y progresión del cáncer. Todos los sustratos conocidos de CRL4Cdt2 tienen un dominio PIP (PCNA Interacting protein) que interactúa con PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) asociado a la cromatina, y es precisamente la unión de los sustratos a PCNA lo que asegura su degradación. Por este motivo, con el objeto de identificar nuevos sustratos de CRL4Cdt2 que permitan ahondar en el mecanismo molecular de acción de este complejo, se realizó una purificación por afinidad en tándem de Cdt2 sobre-expresado y posterior espectrometría de masa en tándem en la fracción cromatínica. A partir de estos resultados se escogieron distintos candidatos teniendo en cuenta la frecuencia de aparición de los mismos en las distintas purificaciones y se logró validar la interacción de Cdt2 sobre-expresado en la cromatina con G9a y GLP. Estas proteínas son metiltransferasas de histonas que catalizan la mono y la dimetilación de la Histona 3 en la Lisina 9, esta marca epigenética se encuentra relacionada con silenciamiento transcripcional y es indispensable para la constitución de la heterocromatina. Debido a que G9a tiene la capacidad de metilar también proteínas no histónicas realizamos un análisis de modificaciones postraduccionales de Cdt2 en una línea control y en líneas knockout que no expresan G9a y GLP (generadas por el sistema CRISPR/Cas9), donde no se encontraron péptidos de Cdt2 metilados diferencialmente en la línea control, aunque se requieren estudios adicionales y más detallados para obtener una respuesta más sólida y definitiva.Logramos identificar y validar la interacción de Cdt2 con otras dos proteínas que interactúan con el complejo G9a/GLP y median su interacción con el ADN. Utilizando ARN de interferencia de Cdt2 comprobamos que la vida media de las proteínas que forman parte de este complejo no se encuentra regulada por esta E3 ligasa, así como tampoco la localización subcelular. Debido a que el silenciamiento de Cdt2 ocasiona re-replicación e inestabilidad genómica, desarrollamos también una línea celular que no expresa Cdt2 endógeno y expresa una construcción Cdt2-Flag que es inducible con doxiciclina. Los experimentos de vida media en diferentes clones de esta línea celular confirmaron los resultados obtenidos con ARN de interferencia. Por último, es importante destacar que CRL4Cdt2 también cumple un rol importante en la regulación de la respuesta celular a estrés genotóxico. Asimismo, recientemente se ha reportado que G9a interviene en la regulación de la respuesta al daño al ADN. Por lo tanto, estamos actualmente estudiando si la interacción funcional entre CRL4Cdt2 y G9a/GLP posee una función importante en la modulación de la respuesta celular a distintos daños. En este sentido hemos obtenidos resultados preliminares muy alentadores. Esperamos que en estudios posteriores podamos ahondar en la caracterización molecular del eje CRL4Cdt2/G9a y la función que cumple en el control de la integridad genómica.SISTEMA UBIQUITINA PROTEOSOMA, E3 LIGASAS, CRL4CDT2, UBIQUITINA, G9A/GLP.Fil: Enriqué Steinberg, Juliana Haydeé. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; Argentin

SCFβTrCP-mediated degradation of SHARP1 in triple-negative breast cancer

: Triple-negative breast cancer (TNBC) is a subtype of breast cancer associated with metastasis, high recurrence rate, and poor survival. The basic helix-loop-helix transcription factor SHARP1 (Split and Hairy-related Protein 1) has been identified as a suppressor of the metastatic behavior of TNBC. SHARP1 blocks the invasive phenotype of TNBC by inhibiting hypoxia-inducible factors and its loss correlates with poor survival of breast cancer patients. Here, we show that SHARP1 is an unstable protein that is targeted for proteasomal degradation by the E3 ubiquitin ligase complex SCFβTrCP. SHARP1 recruits βTrCP via a phosphodegron encompassing Ser240 and Glu245 which are required for SHARP1 ubiquitylation and degradation. Furthermore, mice injected with TNBC cells expressing the non-degradable SHARP1(S240A/E245A) mutant display reduced tumor growth and increased tumor-free survival. Our study suggests that targeting the βTrCP-dependent degradation of SHARP1 represents a therapeutic strategy in TNBC

HERC1 regulates breast cancer cells migration and invasion

Tumor cell migration and invasion into adjacent tissues is one of the hallmarks of cancer and the first step towards secondary tumors formation, which represents the leading cause of cancer-related deaths. This process is considered an unmet clinical need in the treatment of this disease, particularly in breast cancers characterized by high aggressiveness and metastatic potential. To identify and characterize genes with novel functions as regulators of tumor cell migration and invasion, we performed a genetic loss-of-function screen using a shRNA library directed against the Ubiquitin Proteasome System (UPS) in a highly invasive breast cancer derived cell line. Among the candidates, we validated HERC1 as a gene regulating cell migration and invasion. Furthermore, using animal models, our results indicate that HERC1 silencing affects primary tumor growth and lung colonization. Finally, we conducted an in silico analysis using publicly available protein expression data and observed an inverse correlation between HERC1 expression levels and breast cancer patients’ overall survival. Altogether, our findings demonstrate that HERC1 might represent a novel therapeutic target for the development or improvement of breast cancer treatment.Fil: Rossi, Fabiana Alejandra. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Calvo Roitberg, Ezequiel Hernán. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Enriqué Steinberg, Juliana Haydeé. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Joshi, Molishree Umesh. University of Colorado; Estados UnidosFil: Espinosa, Joaquín Maximiliano. University of Colorado; Estados UnidosFil: Rossi, Mario. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; Argentin

USP19 modulates cancer cell migration and invasion and acts as a novel prognostic marker in patients with early breast cancer

Tumor cell dissemination in cancer patients is associated with a significant reduction in their survival and quality of life. The ubiquitination pathway plays a fundamental role in the maintenance of protein homeostasis both in normal and stressed conditions and its dysregulation has been associated with malignant transformation and invasive potential of tumor cells, thus highlighting its value as a potential therapeutic target. In order to identify novel molecular targets of tumor cell migration and invasion we performed a genetic screen with an shRNA library against ubiquitination pathway-related genes. To this end, we set up a protocol to specifically enrich positive migration regulator candidates. We identified the deubiquitinase USP19 and demonstrated that its silencing reduces the migratory and invasive potential of highly invasive breast cancer cell lines. We extended our investigation in vivo and confirmed that mice injected with USP19 depleted cells display increased tumor-free survival, as well as a delay in the onset of the tumor formation and a significant reduction in the appearance of metastatic foci, indicating that tumor cell invasion and dissemination is impaired. In contrast, overexpression of USP19 increased cell invasiveness both in vitro and in vivo, further validating our findings. More importantly, we demonstrated that USP19 catalytic activity is important for the control of tumor cell migration and invasion, and that its molecular mechanism of action involves LRP6, a Wnt co-receptor. Finally, we showed that USP19 overexpression is a surrogate prognostic marker of distant relapse in patients with early breast cancer. Altogether, these findings demonstrate that USP19 might represent a novel therapeutic target in breast cancer.Fil: Rossi, Fabiana Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; Argentina. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Enriqué Steinberg, Juliana Haydeé. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; Argentina. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; ArgentinaFil: Calvo Roitberg, Ezequiel Hernán. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; ArgentinaFil: Joshi, Molishree Umesh. University of Colorado; Estados UnidosFil: Pandey, Ahwan. No especifíca;Fil: Abba, Martín Carlos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Centro de Investigaciones Inmunológicas Básicas y Aplicadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Dufrusine, Beatrice. University of Chieti-Pescara; ItaliaFil: Buglioni, Simonetta. Regina Elena Cancer Institute; ItaliaFil: De Laurenzi, Vincenzo. University of Chieti-Pescara; ItaliaFil: Sala, Gianluca. University of Chieti-Pescara; ItaliaFil: Lattanzio, Rossano. University of Chieti-Pescara; ItaliaFil: Espinosa, Joaquín Maximiliano. University of Colorado; Estados UnidosFil: Rossi, Mario. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional; Argentin

USP19 modulates cancer cell migration and invasion and acts as a novel prognostic marker in patients with early breast cancer

Tumor cell dissemination in cancer patients is associated with a significant reduction in their survival and quality of life. The ubiquitination pathway plays a fundamental role in the maintenance of protein homeostasis both in normal and stressed conditions and its dysregulation has been associated with malignant transformation and invasive potential of tumor cells, thus highlighting its value as a potential therapeutic target. In order to identify novel molecular targets of tumor cell migration and invasion we performed a genetic screen with an shRNA library against ubiquitination pathway-related genes. To this end, we set up a protocol to specifically enrich positive migration regulator candidates. We identified the deubiquitinase USP19 and demonstrated that its silencing reduces the migratory and invasive potential of highly invasive breast cancer cell lines. We extended our investigation in vivo and confirmed that mice injected with USP19 depleted cells display increased tumor-free survival, as well as a delay in the onset of the tumor formation and a significant reduction in the appearance of metastatic foci, indicating that tumor cell invasion and dissemination is impaired. In contrast, overexpression of USP19 increased cell invasiveness both in vitro and in vivo, further validating our findings. More importantly, we demonstrated that USP19 catalytic activity is important for the control of tumor cell migration and invasion, and that its molecular mechanism of action involves LRP6, a Wnt co-receptor. Finally, we showed that USP19 overexpression is a surrogate prognostic marker of distant relapse in patients with early breast cancer. Altogether, these findings demonstrate that USP19 might represent a novel therapeutic target in breast cancer.Facultad de Ciencias MédicasCentro de Investigaciones Inmunológicas Básicas y Aplicada