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Molekulare Mechanismen der zellulären Immunantwort in marinen Evertebraten
Invertebrate and vertebrate organisms alike rely on efficient immune mechanisms to cope with potentially harmful microbes. Immune cells of invertebrates, e.g. hemocytes in bivalves, perform innate but not adaptive immune responses as found in lymphatic cells of jawed vertebrates. Since several genes and principles of innate immunity are highly conserved throughout the animal kingdom, invertebrates are sometimes even regarded as a simplified model of the vertebrate innate immune system. Most invertebrate animals belong to one of the three major bilaterian clades: Deuterostomia, Ecdysozoa or Lophotrochozoa. Whereas research on innate immunity was mainly conducted in the first two groups, information about molecular immune mechanisms in the Lophotrochozoa, including molluscs such as bivalves, is still scarce. In addition, marine, invertebrate filter feeders, such as bivalves, are especially suited to elucidate evolutionary conserved immune responses, since they are constantly in direct contact with the surrounding sea water and, hence, with the microbiota within. Therefore, this project aimed to identify and characterize putative conserved and important proteins and pathways of innate immune responses at molecular level in bivalves, including the ocean quahog, Arctica islandica, the Antarctic bivalve Laternula elliptica and especially the ecologically and economically important blue mussel Mytilus edulis.
To provide the molecular basis for subsequent investigations, transcriptome datasets of unstimulated and flagellin-challenged M. edulis hemocytes were generated using massively parallel sequencing techniques (Roche 454). Comparative analysis of putative conserved pathways in the generated and existing M. edulis transcriptome datasets displayed an enrichment of putative immune relevant pathways in hemocytes. Furthermore, deeper insights into the time-dependent mRNA expression pattern of selected receptors, regulators and effectors of potential immune pathways in M. edulis revealed early- (e.g. NF-κB pathway members) and late-inducible (e.g. Toll-like receptors) immune gene orthologs in response to flagellin stimulation. The transcriptome datasets also offered the molecular background to detect and characterize phylogenetic ancient immune gene orthologs in bivalves possessing also a great relevance in the human immune system, such as genes potentially coding for NOX/DUOX enzymes and IL-17-like cytokines.
One important and phylogenetic conserved immune response investigated in this study was the production of reactive oxygen species (ROS). In humans and also lower animals, such as sea urchins and nematodes, enzymes of the NADPH oxidase (NOX) and dual oxidase (DUOX) family are mainly responsible for the production of ROS. Accordant to various other studies, hemocytes of M. edulis depicted a clear dose- and time-dependent ROS production in response to immune stimulation in the present study. But despite the large number of studies dealing with the generation of ROS in molluscs, the present study was the first to identify putative NOX and DUOX orthologs as well as their subunits in bivalves and even presents one of the first studies in the whole superphylum of Lophotrochozoa. Phylogenetic analyses of these orthologs depicted a closer relationship of deuterostome DUOX orthologs to Lophotrochozoan than to Ecdysozoan orthologs, which underlines the suitability of Lophotrochozoan model organisms for the investigation of the innate immune system from an evolutionary perspective. Furthermore, DUOX orthologs clustered in three distinct groups in the phylogenetic analysis, which mostly coincide with their specific expression pattern among tissues. Orthologs comprising the DUOX-b cluster displayed a particularly high mRNA expression in hemocytes in contrast to other tissues and even to other major immune gene orthologs. On the other hand, the fast and high induction of DUOX expression upon immune stimulation did not correlate with ROS production in M. edulis hemocytes. Nevertheless, the high transcript levels of DUOX-b in hemocytes, its increased transcription in response to immune challenge and a reduced ROS production, when using the inhibitor BAPTA, provides strong evidence for a role of DUOX-b in the innate immune response of bivalves.
Mammals use a multitude of cytokine families to communicate within and between cells. Many of these families cannot be found in invertebrates; one major exception are proteins belonging to the interleukin 17 (IL 17) family of cytokines. In the present study, transcripts of two potential IL-17 orthologs were identified and characterized in M. edulis and L. elliptica as well as one ortholog in A. islandica. At least one ortholog in each bivalve depicted a high mRNA expression in gill tissue in comparison to other tissues and hemocytes. In hemocytes of M. edulis, however, transcription of both IL-17 orthologs was highly inducible using various immune stimulants. The resulting expression profiles varied depending on the ortholog and stimulus applied, supporting the presence of two distinctive orthologs with potentially differing functions in bivalves.
This study provided a deeper understanding of flagellin-mediated defense mechanisms in M. edulis. Additionally, it gave insights into the conservation and transcriptional regulation of two families of immune gene orthologs in a phylogenetic older group of animals. Thereby, the present study contributes to a more complete view on the evolution of the innate immune system itself.Evertebraten wie auch Vertebraten benötigen gleichermaßen effiziente Immunmechanismen, um potenziell schädliche Mikroben abzuwehren. Die Immunzellen der Evertebraten, wie z.B. Hämozyten in Muscheln, können angeborene aber nicht adaptive Immunantworten, wie sie in lymphatischen Zellen der kiefertragenden Wirbeltiere vorkommen, ausführen. Da mehrere Gene und Gesetzmäßigkeiten der angeborenen Immunität im Tierreich hoch konserviert sind, werden Evertebraten mitunter als vereinfachtes Modell des angeborenen Immunsystems der Wirbeltiere angesehen. Die meisten wirbellosen Tiere gehören einem der drei Hauptstämme der Bilateria an: den Deuterostomia, Ecdysozoa oder Lophotrochozoa. Bisher wurden hauptsächlich Untersuchungen in den ersten beiden Gruppen durchgeführt, wohingegen nur begrenzte Kenntnisse über die molekularen Immunmechanismen der Lophotrochozoa, zu denen auch Weichtiere wie z.B. Muscheln gehören, vorhanden sind. Hinzu kommt, dass wirbellose, marine Filtrierer, wie z.B. Muscheln, im Besonderen geeignet sind, um evolutionär konservierte Immunantworten zu untersuchen, da sie kontinuierlich dem umgebenden Seewasser und somit auch den darin enthaltenden Mikroorganismen ausgesetzt sind. Ziel dieser Studie war es daher, wichtige, putativ konservierte Proteine und Signalwege der angeborenen Immunantwort in Muscheln auf molekularer Ebene zu identifizieren und zu charakterisieren. Dies beinhaltete Untersuchungen in der Islandmuschel, Arctica islandica, der antarktischen Muschel Laternula elliptica und insbesondere der ökologisch und ökonomisch bedeutenden Miesmuschel, Mytilus edulis.
Die molekulare Grundlage für sich anschließende Analysen bildeten die mit Hilfe von moderner Hochdurchsatz-Sequenziermethoden (454 Roche) generierten Transkriptomdatensätze unstimulierter und Flagellin-stimulierter Hämozyten von M. edulis. Vergleichende Untersuchungen zu potenziell konservierten Signalwegen in den generierten und bereits vorhandenen M. edulis Transkriptomdatensätzen ergaben eine Anreicherung von putativ immunrelevanten Signalwegen in Hämozyten. Des Weiteren ließ eine detailierte Analyse zeitabhängiger mRNA Expressionsmuster ausgewählter Rezeptoren, Regulatoren und Effektoren von potenziell immunrelevanten Signalwegen in M. edulis nach Flagellinstimulation früh (z.B. Mitglieder des NF-κB Signalweges) und spät induzierte (z.B. Toll-ähnliche Rezeptoren) Orthologe von Immungenen erkennen. Zusätzlich boten Transkriptom-datensätze den molekularen Hintergrund, um phylogenetisch ursprüngliche Immungen Orthologe zu ermitteln und zu charakterisieren, die auch von großer Bedeutung im humanen Immunsystem sind.
Eine wichtige und phylogenetisch konservierte Immunantwort ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Im Menschen wie auch in Niederen Tieren, wie z.B. Seeigel und Fadenwürmer, sind Enzyme der NADPH- (NOX) und Dualen Oxidasen (DUOX) maßgeblich für die Produktion von ROS verantwortlich. In Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in dieser Studie ebenfalls eine dosis- und zeitabhängige ROS Produktion in Hämozyten von M. edulis nach Immunstimulation gezeigt werden. Trotz der hohen Anzahl von Studien, die sich mit der Generierung von ROS in Weichtieren beschäftigen, ist dies die erste Studie, in der die Identifizierung von NOX und DUOX Orthologen sowie ihrer Untereinheiten in Muscheln erfolgte und damit eine der ersten Studien im gesamten Überstamm der Lophotrochozoa. Die durchgeführten phylogenetischen Analysen wiesen auf einen höheren Verwandtschaftsgrad von DUOX Orthologen der Deuterostomier zu denen der Lophotrochozoa als zu denen der Ecdysozoa hin, welches die Eignung von Lophotrochozoen als Modell zur Erforschung der Evolution des angeborenen Immunsystems unterstreicht. Des Weiteren wurden die DUOX Orthologe mithilfe der phylogenetischen Analyse in drei verschiedene Gruppen eingeteilt, die sich größtenteils mit ihrem individuellen, gewebespezifischen Expressionsmuster deckten. Orthologe der DUOX-b Gruppe besaßen eine besonders hohe mRNA Expression in Hämozyten verglichen mit anderen Geweben und besonders im Vergleich mit anderen, bedeutenden Immungenen. Im Gegensatz dazu steht, dass die schnelle und starke Induktion der DUOX Expression nach Immunstimulation sich nicht mit der ROS Produktion in Hämozyten von M. edulis deckte. Dennoch deuten die hohe basale Expression von DUOX-b Transkripten in Hämozyten, die erhöhte DUOX Transkription nach Immunstimulation und eine reduzierte ROS Produktion bei Einsatz des Inhibitors BAPTA verstärkt auf eine Rolle von DUOX-b im Immunsystem der Muscheln hin.
Säugetiere bedienen sich einer Vielzahl von Zytokin-Familien zur intra- und extrazellulären Kommunikation. Viele dieser Familien können jedoch nicht in Evertebraten vorgefunden werden; Eine große Ausnahme hierzu stellen Zytokine der Interleukin-17 (IL-17) Familie dar. In dieser Studie wurden Transkripte je zwei potenzieller IL 17 Orthologe für M. edulis und L. elliptica sowie ein Ortholog für A. islandica beschrieben. Mindestens ein Ortholog je Muschel wies, im Vergleich zu anderen Geweben sowie Hämozyten, sehr hohe Transkriptlevel im Kiemengewebe auf. Dennoch war die Transkription der IL-17 Orthologe in Hämozyten von M. edulis mit Hilfe von verschiedenen Immunstimuli stark induzierbar. Dabei war das resultierende Expressionsprofil stark vom betrachteten Ortholog und Stimulus abhängig, welches das Vorkommen von zwei differenten IL-17 Orthologen mit potenziell unterschiedlicher Funktion in Muscheln bekräftigt.
Erkenntnisse aus dieser Arbeit lieferten tiefere Einsichten in die Flagellin-vermittelte Abwehrreaktion in M. edulis. Zusätzlich wurden die Konservierung und transkriptionelle Regulation zweier orthologer Familien von Immungenen eines phylogenetisch ursprünglicheren Tierstammes genauer erläutert. Auf diese Weise konnte die Studie zu umfassenderen Kenntnissen über die Evolution des angeborenen Immunsystems selber beitragen
Calcifying invertebrates succeed in a naturally CO2 enriched coastal habitat but are threatened by high levels of future acidification
CO2 emissions are leading to an acidification of the oceans. Predicting marine community vulnerability towards acidification is difficult, as adaptation processes cannot be accounted for in most experimental studies. Naturally CO2 enriched sites thus can serve as valuable proxies for future changes in community structure. Here we describe a natural analogue site in the Western Baltic Sea. Seawater pCO2 in Kiel Fjord is elevated for large parts of the year due to upwelling of CO2 rich waters. Peak pCO2 values of >230 Pa (>2300 μatm) and pHNBS values of 400 Pa (>4000 μatm). These changes will most likely affect calcification and recruitment, and increase external shell dissolution
Specific immune priming in the invasive ctenophore Mnemiopsis leidyi
Specific immune priming enables an induced immune response upon repeated pathogen encounter. As a functional analogue to vertebrate immune memory, such adaptive plasticity has been described, for instance, in insects and crustaceans. However, towards the base of the metazoan tree our knowledge about the existence of specific immune priming becomes scattered. Here, we exposed the invasive ctenophore Mnemiopsis leidyi repeatedly to two different bacterial epitopes (Gram-positive or -negative) and measured gene expression. Ctenophores experienced either the same bacterial epitope twice (homologous treatments) or different bacterial epitopes (heterologous treatments). Our results demonstrate that immune gene expression depends on earlier bacterial exposure. We detected significantly different expression upon heterologous compared with homologous bacterial treatment at three immune activator and effector genes. This is the first experimental evidence for specific immune priming in Ctenophora and generally in non-bilaterian animals, hereby adding to our growing notion of plasticity in innate immune systems across all animal phyla
Oxygen and capacity limited thermal tolerance of the lugworm Arenicola marina: A seasonal comparison
Lugworms Arenicola marina were collected from Arcachon Bay in two summers and winters of consecutive
years. The worms were acclimated to different temperatures (5 and 10 °C for winter animals and 15 °C for
summer animals). Each group was investigated over an experimental temperature range concerning its optimum
in exercise performance, acute growth rate as well as respiration and ventilation activities to reveal
seasonal acclimatisation effects, potential inter-annual differences and the influence of laboratory acclimation
temperatures on the parameters of interest. The groups investigated at the two consecutive summers
yielded nearly identical results for ventilation and respiration activities. A clear seasonal difference developed
in exercise performance, with an optimum at lower temperatures in winter than in summer, irrespective of
acclimation temperature. Respiration and ventilation activities showed no significant differences between
winter specimens acclimated to 10 °C and summer specimens acclimated to 15 °C. However, an acclimation
temperature of 5 °C for winter animals caused noticeable differences to those acclimated at 10 °C. Acute
growth rates differed seasonally as well as between acclimation temperatures with the highest rates found
around 10 °C in summer and around 15 °C in winter. The lowest rates were recorded in winter worms acclimated
to 5 °C. These acute patterns may reflect high thermal limits in warm acclimated winter worms and
temperature dependent shifts in energy demand in summer animals