Molekulare Mechanismen während der Anheftung und Biofilmbildung in Shewanella oneidensis MR-1 - Die Tücken des Besiedelns -

Grenzflächenbesiedlung durch robuste Bakteriengemeinschaften – sogenannten Biofilmen – stellt die ubiquitär verbreitete Lebensform von Mikroorganismen dar, um einer Vielzahl von Stressfaktoren zu widerstehen. Das Entwicklungsprogramm solcher Biofilme lässt sich in mehrere distinkte Schritte unterteilen, wobei zu Anfang eine zunächst transiente Anheftung Oberflächen- assoziierter Zellen steht, auf die eine irreversible Interaktion mit dem Substratum folgt. Nach der Bildung von Mikrokolonien entstehen im weiteren Verlauf drei-dimensionale Strukturen, die als charakteristisches Merkmal für Biofilme gelten. Das dissimilatorisch Metallionen-reduzierende Bakterium Shewanella oneidensis MR-1 bildet Biofilme unter statischen wie hydrodynamischen Bedingungen aus. Die Ausprägungsformen des Biofilms unterscheiden sich jedoch stark in Abgängigkeit von den vorherrschenden Bedingungen. So bildet S. oneidensis MR-1 unter statischen Bedingungen eine eher lockere netzartige Biofilmstruktur, durch die sich Zellen bewegen können. Hydrodynamische Bedingungen haben zur Folge, dass sich turmartige Strukturen, welche vornehmlich durch klonales Wachstum entstehen, ausbilden, die von einer dichtgepackten, widerstandsfähigen Matrix zusammengehalten werden. Um zelluläre Prozesse während der Oberflächen-Anheftung in Abhängigkeit der vorherrschenden Bedingung mit Hilfe von Transkriptom-Analysen zu identifizieren, wurde ein System zur Isolierung von Oberflächen-assoziierten Zellen in einem hydrodynamischen Umfeld etabliert. Die Transkriptom-Analysen adhärierter Zellen unter statischen und hydrodynamischen Bedingungen zeigten, dass die initiale Anheftung dieses Organismus, als erster Schritt in die Richtung eines sessilen Lebensstils im Biofilm, weitreichende Veränderungen des Transkriptoms nach sich zieht. Dabei lässt sich zwischen einer allgemeinen, jedoch umweltabhängigen Anpassung, die vor allem eine Reduzierung der Motilität und – unter statischen Bedingungen – eine rapide wie effiziente Umstellung auf anaeroben Stoffwechsel beinhaltet, und einer Substrat-spezifischen Adaption unterscheiden. So hat beispielsweise eine Anheftung an eine Eisen(hydr)oxid-Oberfläche zur Folge, dass – wahrscheinlich aufgrund des Überangebots an Elektronenakzeptoren – besonders Transportsysteme und Cytochrome reprimiert, dagegen stressabhängige Sigmafaktoren induziert werden. Im weiteren Verlauf der Anheftung und Biofilmentwicklung produzieren die S. oneidensis MR-1 Zellen eine Biofilm-Matrix, die zu einem entscheidenden Teil aus extrazellulärer DNA (eDNA) besteht. Als strukturgebendes Element spielt die eDNA in Biofilmen sowohl unter statischen, als auch unter hydrodynamischen Bedingungen eine wichtige Rolle. Die Herkunft dieser eDNA konnte auf zelllytische Prozesse – ausgelöst durch Phagen-induzierte Lyse einer Subpopulation von Zellen – zurückgeführt werden. Die durch die lytische Aktivität der drei Shewanella-eigenen Prophagen (MuSo1, MuSo2 und LambdaSo) freigesetzte DNA ist bereits in den ersten Schritten der Anheftung essenziell. Eine Mutante, in der alle drei Prophagen deletiert wurden, wies massive Defekte in allen Stadien der Biofilmbildung auf. Mutanten-Analysen und Infektionsstudien zeigten des Weiteren, dass nur die Prophagen MuSo2 und LambdaSo in den lytischen Lebenszyklus konvertieren und infektiöse Viruspartikel assemblieren können. Um die dynamische Besiedelung einer Oberfläche zu gewährleisten, gehen einige Zellen während aller Entwicklungsstufen der Biofilmbildung zu einem erneut planktonischen Lebensstil über. Dieser kontrollierte Übergang scheint unter anderem auch die Fähigkeit zur Degradierung von Komponenten der Biofilm-Matrix – insbesondere eDNA – vorauszusetzen. Zwei Kandidaten für solche DNA-degradierenden Prozesse stellen die extrazellulären Endonukleasen ExeM und ExeS dar, die vermutlich sowohl die Akkumulation, als auch das Ablösen von Biofilm-Biomasse aktiv mitgestalten, und zusätzlich – zumindest bei ExeM – in der Verwertbarkeit von DNA als Phosphatquelle eine Rolle spielen

Crenarchaeal Biofilm Formation under Extreme Conditions

Background: Biofilm formation has been studied in much detail for a variety of bacterial species, as it plays a major role in the pathogenicity of bacteria. However, only limited information is available for the development of archaeal communities that are frequently found in many natural environments. Methodology: We have analyzed biofilm formation in three closely related hyperthermophilic crenarchaeotes: Sulfolobus acidocaldarius, S. solfataricus and S. tokodaii. We established a microtitre plate assay adapted to high temperatures to determine how pH and temperature influence biofilm formation in these organisms. Biofilm analysis by confocal laser scanning microscopy demonstrated that the three strains form very different communities ranging from simple carpet-like structures in S. solfataricus to high density tower-like structures in S. acidocaldarius in static systems. Lectin staining indicated that all three strains produced extracellular polysaccharides containing glucose, galactose, mannose and N-acetylglucosamine once biofilm formation was initiated. While flagella mutants had no phenotype in two days old static biofilms of S. solfataricus, a UV-induced pili deletion mutant showed decreased attachment of cells. Conclusion: The study gives first insights into formation and development of crenarchaeal biofilms in extrem

Percutaneous Anorectoplasty (PARP)-An Adaptable, Minimal-Invasive Technique for Anorectal Malformation Repair

Background: Anorectal malformations comprise a broad spectrum of disease. We developed a percutaneous anorectoplasty (PARP) technique as a minimal-invasive option for repair of amenable types of lesions. Methods: Patients who underwent PARP at five institutions from 2008 through 2021 were retrospectively analyzed. Demographic information, details of the operative procedure, and perioperative complications and outcomes were collected. Results: A total of 10 patients underwent the PARP procedure during the study interval. Patients either had low perineal malformations or no appreciable fistula. Most procedures were guided by ultrasound, fluoroscopy, or endoscopy. Median age at PARP was 3 days (range 1 to 311) days;eight patients were male. Only one intraoperative complication occurred, prompting conversion to posterior sagittal anorectoplasty. Functional outcomes in most children were highly satisfactory in terms of continence and functionality. Conclusions: The PARP technique is an excellent minimal-invasive alternative for boys born with perineal fistulae, as well as patients of both sexes without fistulae. The optimal type of guidance (ultrasound, fluoroscopy, or endoscopy) depends on the anatomy of the lesion and the presence of a colostomy at the time of repair

Recycling of Peptidyl-tRNAs by Peptidyl-tRNA Hydrolase Counteracts Azithromycin-Mediated Effects on Pseudomonas aeruginosa.

Acute and chronic infections caused by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa pose a serious threat to human health worldwide, and its increasing resistance to antibiotics requires alternative treatments that are more effective than available strategies. Clinical studies have clearly demonstrated that cystic fibrosis (CF) patients with chronic P. aeruginosa infections benefit from long-term low-dose azithromycin (AZM) treatment. Immunomodulating activity, the impact of AZM on the expression of quorum-sensing-dependent virulence factors, type three secretion, and motility in P. aeruginosa seem to contribute to the therapeutic response. However, to date, the molecular mechanisms underlying these AZM effects have remained elusive. Our data indicate that the AZM-mediated phenotype is caused by a depletion of the intracellular pools of tRNAs available for protein synthesis. Overexpression of the P. aeruginosa peptidyl-tRNA hydrolase, which recycles the tRNA from peptidyl-tRNA drop-off during translation, counteracted the effects of AZM on stationary-phase cell killing, cytotoxicity, and the production of rhamnolipids and partially restored swarming motility. Intriguingly, the exchange of a rare for a frequent codon in rhlR also explicitly diminished the AZM-mediated decreased production of rhamnolipids. These results indicate that depletion of the tRNA pools by AZM seems to affect the translation of genes that use rare aminoacyl-tRNA isoacceptors to a great extent and might explain the selective activity of AZM on the P. aeruginosa proteome and possibly also on the protein expression profiles of other bacterial pathogens.Acute and chronic infections caused by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa pose a serious threat to human health worldwide, and its increasing resistance to antibiotics requires alternative treatments that are more effective than available strategies. Clinical studies have clearly demonstrated that cystic fibrosis (CF) patients with chronic P. aeruginosa infections benefit from long-term low-dose azithromycin (AZM) treatment. Immunomodulating activity, the impact of AZM on the expression of quorum-sensing-dependent virulence factors, type three secretion, and motility in P. aeruginosa seem to contribute to the therapeutic response. However, to date, the molecular mechanisms underlying these AZM effects have remained elusive. Our data indicate that the AZM-mediated phenotype is caused by a depletion of the intracellular pools of tRNAs available for protein synthesis. Overexpression of the P. aeruginosa peptidyl-tRNA hydrolase, which recycles the tRNA from peptidyl-tRNA drop-off during translation, counteracted the effects of AZM on stationary-phase cell killing, cytotoxicity, and the production of rhamnolipids and partially restored swarming motility. Intriguingly, the exchange of a rare for a frequent codon in rhlR also explicitly diminished the AZM-mediated decreased production of rhamnolipids. These results indicate that depletion of the tRNA pools by AZM seems to affect the translation of genes that use rare aminoacyl-tRNA isoacceptors to a great extent and might explain the selective activity of AZM on the P. aeruginosa proteome and possibly also on the protein expression profiles of other bacterial pathogens

Molekulare Mechanismen während der Anheftung und Biofilmbildung in Shewanella oneidensis MR-1 - Die Tücken des Besiedelns -

Grenzflächenbesiedlung durch robuste Bakteriengemeinschaften – sogenannten Biofilmen – stellt die ubiquitär verbreitete Lebensform von Mikroorganismen dar, um einer Vielzahl von Stressfaktoren zu widerstehen. Das Entwicklungsprogramm solcher Biofilme lässt sich in mehrere distinkte Schritte unterteilen, wobei zu Anfang eine zunächst transiente Anheftung Oberflächen- assoziierter Zellen steht, auf die eine irreversible Interaktion mit dem Substratum folgt. Nach der Bildung von Mikrokolonien entstehen im weiteren Verlauf drei-dimensionale Strukturen, die als charakteristisches Merkmal für Biofilme gelten. Das dissimilatorisch Metallionen-reduzierende Bakterium Shewanella oneidensis MR-1 bildet Biofilme unter statischen wie hydrodynamischen Bedingungen aus. Die Ausprägungsformen des Biofilms unterscheiden sich jedoch stark in Abgängigkeit von den vorherrschenden Bedingungen. So bildet S. oneidensis MR-1 unter statischen Bedingungen eine eher lockere netzartige Biofilmstruktur, durch die sich Zellen bewegen können. Hydrodynamische Bedingungen haben zur Folge, dass sich turmartige Strukturen, welche vornehmlich durch klonales Wachstum entstehen, ausbilden, die von einer dichtgepackten, widerstandsfähigen Matrix zusammengehalten werden. Um zelluläre Prozesse während der Oberflächen-Anheftung in Abhängigkeit der vorherrschenden Bedingung mit Hilfe von Transkriptom-Analysen zu identifizieren, wurde ein System zur Isolierung von Oberflächen-assoziierten Zellen in einem hydrodynamischen Umfeld etabliert. Die Transkriptom-Analysen adhärierter Zellen unter statischen und hydrodynamischen Bedingungen zeigten, dass die initiale Anheftung dieses Organismus, als erster Schritt in die Richtung eines sessilen Lebensstils im Biofilm, weitreichende Veränderungen des Transkriptoms nach sich zieht. Dabei lässt sich zwischen einer allgemeinen, jedoch umweltabhängigen Anpassung, die vor allem eine Reduzierung der Motilität und – unter statischen Bedingungen – eine rapide wie effiziente Umstellung auf anaeroben Stoffwechsel beinhaltet, und einer Substrat-spezifischen Adaption unterscheiden. So hat beispielsweise eine Anheftung an eine Eisen(hydr)oxid-Oberfläche zur Folge, dass – wahrscheinlich aufgrund des Überangebots an Elektronenakzeptoren – besonders Transportsysteme und Cytochrome reprimiert, dagegen stressabhängige Sigmafaktoren induziert werden. Im weiteren Verlauf der Anheftung und Biofilmentwicklung produzieren die S. oneidensis MR-1 Zellen eine Biofilm-Matrix, die zu einem entscheidenden Teil aus extrazellulärer DNA (eDNA) besteht. Als strukturgebendes Element spielt die eDNA in Biofilmen sowohl unter statischen, als auch unter hydrodynamischen Bedingungen eine wichtige Rolle. Die Herkunft dieser eDNA konnte auf zelllytische Prozesse – ausgelöst durch Phagen-induzierte Lyse einer Subpopulation von Zellen – zurückgeführt werden. Die durch die lytische Aktivität der drei Shewanella-eigenen Prophagen (MuSo1, MuSo2 und LambdaSo) freigesetzte DNA ist bereits in den ersten Schritten der Anheftung essenziell. Eine Mutante, in der alle drei Prophagen deletiert wurden, wies massive Defekte in allen Stadien der Biofilmbildung auf. Mutanten-Analysen und Infektionsstudien zeigten des Weiteren, dass nur die Prophagen MuSo2 und LambdaSo in den lytischen Lebenszyklus konvertieren und infektiöse Viruspartikel assemblieren können. Um die dynamische Besiedelung einer Oberfläche zu gewährleisten, gehen einige Zellen während aller Entwicklungsstufen der Biofilmbildung zu einem erneut planktonischen Lebensstil über. Dieser kontrollierte Übergang scheint unter anderem auch die Fähigkeit zur Degradierung von Komponenten der Biofilm-Matrix – insbesondere eDNA – vorauszusetzen. Zwei Kandidaten für solche DNA-degradierenden Prozesse stellen die extrazellulären Endonukleasen ExeM und ExeS dar, die vermutlich sowohl die Akkumulation, als auch das Ablösen von Biofilm-Biomasse aktiv mitgestalten, und zusätzlich – zumindest bei ExeM – in der Verwertbarkeit von DNA als Phosphatquelle eine Rolle spielen

Transcriptome analysis of early surface-associated growth of Shewanella oneidensis MR-1.

Bacterial biofilm formation starts with single cells attaching to a surface, however, little is known about the initial attachment steps and the adaptation to the surface-associated life style. Here, we describe a hydrodynamic system that allows easy harvest of cells at very early biofilm stages. Using the metal ion-reducing gammaproteobacterium Shewanella oneidensis MR-1 as a model organism, we analyzed the transcriptional changes occurring during surface-associated growth between 15 and 60 minutes after attachment. 230 genes were significantly upregulated and 333 were downregulated by a factor of ≥ 2. Main functional categories of the corresponding gene products comprise metabolism, uptake and transport, regulation, and hypothetical proteins. Among the genes highly upregulated those implicated in iron uptake are highly overrepresented, strongly indicating that S. oneidensis MR-1 has a high demand for iron during surface attachment and initial biofilm stages. Subsequent microscopic analysis of biofilm formation under hydrodynamic conditions revealed that addition of Fe(II) significantly stimulated biofilm formation of S. oneidensis MR-1 while planktonic growth was not affected. Our approach to harvest cells for transcriptional analysis of early biofilm stages is expected to be easily adapted to other bacterial species

Phage-induced lysis enhances biofilm formation in Shewanella oneidensis MR-1

Shewanella oneidensis MR-1 is capable of forming highly structured surface-attached communities. By DNase I treatment, we demonstrated that extracellular DNA (eDNA) serves as a structural component in all stages of biofilm formation under static and hydrodynamic conditions. We determined whether eDNA is released through cell lysis mediated by the three prophages LambdaSo, MuSo1 and MuSo2 that are harbored in the genome of S. oneidensis MR-1. Mutant analyses and infection studies revealed that all three prophages may individually lead to cell lysis. However, only LambdaSo and MuSo2 form infectious phage particles. Phage release and cell lysis already occur during early stages of static incubation. A mutant devoid of the prophages was significantly less prone to lysis in pure culture. In addition, the phage-less mutant was severely impaired in biofilm formation through all stages of development, and three-dimensional growth occurred independently of eDNA as a structural component. Thus, we suggest that in S. oneidensis MR-1 prophage-mediated lysis results in the release of crucial biofilm-promoting factors, in particular eDNA

Differentially regulated genes potentially related to iron homeostasis.

<p>Differentially regulated genes potentially related to iron homeostasis.</p

Coverage of a glass surface after inoculation and medium flow for 15 (upper image) and 60 minutes (lower image).

<p>Displayed are images taken by confocal laser scanning microscopy in flow chambers at the indicated time points. The lateral edge of each image equals 250 µm. The values given represent the average and standard deviation of surface coverage in percent of 6 randomly selected spots in three different channels of a flow chamber.</p

Differentially regulated genes related to “metabolic adaptation” – amino acid transport and metabolism.

<p>Differentially regulated genes related to “metabolic adaptation” – amino acid transport and metabolism.</p