Fisiopatología de modelos murinos de α-sinucleína y enfermedad de Parkinson

[spa] La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común, afectando al 1 % de la población de más de 60 años. La EP se caracteriza por síntomas motores como el temblor en reposo, la bradicinesia y la rigidez, los cuales van ligados al diagnóstico de la enfermedad; sin embargo, existen otros síntomas no motores que aparecen en los años previos, como trastornos del sueño, trastornos digestivos, ansiedad o depresión. Los síntomas motores tienen su origen en la muerte selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNc), una región del mesencéfalo encargada del control del movimiento. Estas neuronas proyectan sus axones al estriado dorsal, como parte del circuito motor de los ganglios basales, y se estima que haya una pérdida del 70 % de estos axones y del 50 % de somas dopaminérgicos en el momento de aparición de los síntomas. Otra de las características histopatológicas de la EP es la presencia de inclusiones neuronales intracelulares denominadas cuerpos de Lewy, constituidas, entre otros componentes celulares, por agregados insolubles de la proteína α-sinucleína (αSyn). Además, mutaciones y multiplicaciones en el gen codificante de αSyn producen EP familiar, lo que convierte a αSyn en una proteína central en la patogénesis de esta enfermedad neurodegenerativa. Los eventos fisiopatológicos asociados con el exceso y/o la agregación de αSyn incluyen alteraciones en los terminales presinápticos, pero también defectos en la homeostasis mitocondrial, en las rutas degradativas celulares y neuroinflamación. Otros determinantes genéticos de la EP están implicados en estos mismos procesos celulares, y se ha determinado que los cuerpos de Lewy contienen proteínas axonales, mitocondrias, lisosomas y autofagosomas. La función de αSyn sigue sin estar esclarecida en la actualidad, y únicamente se ha descrito su papel en la regulación y exocitosis de vesículas de neurotransmisores en la sinapsis; sin embargo, no se conoce su papel fisiológico en otros procesos celulares relevantes para la fisiopatología de la EP. En esta tesis hemos investigado los principales eventos y componentes celulares implicados en la neurodegeneración en dos modelos murinos: un modelo transgénico de EP familiar, que sobreexpresa la proteína αSyn humana sobre un fondo sin αSyn murina (SNCA-OVX), y un modelo knockout que carece de la proteína (Snca-/-). Hemos detectado que existe un solapamiento fisiopatológico temprano entre ambos modelos y, además, que la ausencia de αSyn en animales Snca-/- es suficiente para generar defectos de coordinación motora, una inducción autofágica en tejido y neuronas estriatales e incrementos lisosomales, tanto en el estriado como en la SNc. El déficit de αSyn también provoca cambios transcriptómicos en componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en tejido estriatal y mesencefálico, un aumento de crestas en las mitocondrias estriatales y un incremento de los contactos entre las mitocondrias y los lisosomas, necesarios para la correcta dinámica, funcionalidad y distribución de estos orgánulos. Aunque el modelo SNCA-OVX presenta alteraciones motoras específicas, como cambios en la marcha, comparte la inducción autofágica, los incrementos lisosomales y, parcialmente, los defectos transcripcionales bioenergéticos. Por otra parte, los modelos de αSyn también comparten activaciones de rutas de señalización relevantes para respuestas inmunes, pero, a diferencia de la sobreexpresión, la ausencia de αSyn reduce la microglía neurotóxica en el estriado y la SNc. Estos resultados ponen de manifiesto que la función de αSyn es necesaria para procesos celulares afectados en la EP, como el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial, lisosomal, degradativa, y para las respuestas inmunes, y apoyarían la idea de que pueda haber un componente de pérdida de función contribuyendo a la fisiopatología de esta enfermedad neurodegenerativa

Fisiopatología de modelos murinos de α-sinucleína y enfermedad de Parkinson

Programa de Doctorat en Biomedicina / Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Sant Joan de Déu (IRSJD)[spa] La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común, afectando al 1 % de la población de más de 60 años. La EP se caracteriza por síntomas motores como el temblor en reposo, la bradicinesia y la rigidez, los cuales van ligados al diagnóstico de la enfermedad; sin embargo, existen otros síntomas no motores que aparecen en los años previos, como trastornos del sueño, trastornos digestivos, ansiedad o depresión. Los síntomas motores tienen su origen en la muerte selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNc), una región del mesencéfalo encargada del control del movimiento. Estas neuronas proyectan sus axones al estriado dorsal, como parte del circuito motor de los ganglios basales, y se estima que haya una pérdida del 70 % de estos axones y del 50 % de somas dopaminérgicos en el momento de aparición de los síntomas. Otra de las características histopatológicas de la EP es la presencia de inclusiones neuronales intracelulares denominadas cuerpos de Lewy, constituidas, entre otros componentes celulares, por agregados insolubles de la proteína α-sinucleína (αSyn). Además, mutaciones y multiplicaciones en el gen codificante de αSyn producen EP familiar, lo que convierte a αSyn en una proteína central en la patogénesis de esta enfermedad neurodegenerativa. Los eventos fisiopatológicos asociados con el exceso y/o la agregación de αSyn incluyen alteraciones en los terminales presinápticos, pero también defectos en la homeostasis mitocondrial, en las rutas degradativas celulares y neuroinflamación. Otros determinantes genéticos de la EP están implicados en estos mismos procesos celulares, y se ha determinado que los cuerpos de Lewy contienen proteínas axonales, mitocondrias, lisosomas y autofagosomas. La función de αSyn sigue sin estar esclarecida en la actualidad, y únicamente se ha descrito su papel en la regulación y exocitosis de vesículas de neurotransmisores en la sinapsis; sin embargo, no se conoce su papel fisiológico en otros procesos celulares relevantes para la fisiopatología de la EP. En esta tesis hemos investigado los principales eventos y componentes celulares implicados en la neurodegeneración en dos modelos murinos: un modelo transgénico de EP familiar, que sobreexpresa la proteína αSyn humana sobre un fondo sin αSyn murina (SNCA-OVX), y un modelo knockout que carece de la proteína (Snca-/-). Hemos detectado que existe un solapamiento fisiopatológico temprano entre ambos modelos y, además, que la ausencia de αSyn en animales Snca-/- es suficiente para generar defectos de coordinación motora, una inducción autofágica en tejido y neuronas estriatales e incrementos lisosomales, tanto en el estriado como en la SNc. El déficit de αSyn también provoca cambios transcriptómicos en componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en tejido estriatal y mesencefálico, un aumento de crestas en las mitocondrias estriatales y un incremento de los contactos entre las mitocondrias y los lisosomas, necesarios para la correcta dinámica, funcionalidad y distribución de estos orgánulos. Aunque el modelo SNCA-OVX presenta alteraciones motoras específicas, como cambios en la marcha, comparte la inducción autofágica, los incrementos lisosomales y, parcialmente, los defectos transcripcionales bioenergéticos. Por otra parte, los modelos de αSyn también comparten activaciones de rutas de señalización relevantes para respuestas inmunes, pero, a diferencia de la sobreexpresión, la ausencia de αSyn reduce la microglía neurotóxica en el estriado y la SNc. Estos resultados ponen de manifiesto que la función de αSyn es necesaria para procesos celulares afectados en la EP, como el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial, lisosomal, degradativa, y para las respuestas inmunes, y apoyarían la idea de que pueda haber un componente de pérdida de función contribuyendo a la fisiopatología de esta enfermedad neurodegenerativa

Whole-brain 3D imaging of dopaminergic system in Pitx3-deficient aphakia mouse brains

Póster presentado al XIV Meeting of the International Basal Ganglia Society (IBAGS), which will be held in Stockholm on June 13-16, 2023.Pitx3 is a homeobox transcription factor critical for the development and maintenance of midbrain dopaminergic (DA) neurons, i.e.: substantia nigra (SN) neurons (A9 group), ventral tegmental area (VTA) neurons (A10 group), and retrorubral field neurons (A8 group). Nevertheless, different midbrain DA neuron subsets display distinct Pitx3 dependence and, in fact, Pitx3 expression has been found to correlate with the neuronal vulnerabilities reported in midbrains from Parkinson's disease (PD) patients. The aphakia (Ak) mouse is characterized by a congenital severe knockdown of the Pitx3 gene, and these animals show a dramatic loss of DA neurons in the SN and, to a lesser extent, in the VTA. Ak mice exhibit motor phenotypes, but also striatum-dependent cognitive impairments, and olfactory and gastrointestinal dysfunctions, mimicking prodromal and early stages of PD; however, it remains unclear how Pitx3 deficiency drives this heterogeneous symptomatology. In order to dissect the changes occurring in the DA systems from the Ak mouse brains, we performed immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent cleared organs, or iDISCO+ clearing method. We resolved catecholaminergic nuclei at the single-cell resolution to determine other brain regions and systems affected upon Pitx3 deficiency and DA loss. Our results contribute to the understanding of the Ak mouse as a PD model and to determine the neuronal vulnerabilities underlying the main PD co-morbidities.N

Whole-brain 3D imaging of dopaminergic systems in cleared Pitx3-deficient aphakia mouse brains reveals region-specific impairments

Resumen del póster presentado al 11th IBRO World Congress of Neuroscience, celebrado en Granada (España) del 9 al 13 de septiembre de 2023.Pitx3 is a homeobox transcription factor critical for the development and maintenance of midbrain dopaminergic (DA) neurons, i.e.: substantia nigra (SN) neurons (A9 group), ventral tegmental area (VTA) neurons (A10 group), and retrorubral field neurons (A8 group). Nevertheless, different midbrain DA neuron subsets display distinct Pitx3 dependence and, in fact, Pitx3 expression has been found to correlate with the neuronal vulnerabilities reported in midbrains from Parkinson’s disease (PD) patients. The aphakia (Ak) mouse is characterized by a congenital severe knockdown of the Pitx3 gene, and these animals show a dramatic loss of DA neurons in the SN and, to a lesser extent, in the VTA. Ak mice exhibit motor phenotypes, but also striatum-dependent cognitive impairments, and olfactory and gastrointestinal dysfunctions, mimicking prodromal and early stages of PD; however, it remains unclear how Pitx3 deficiency drives this heterogeneous symptomatology. In order to dissect the changes occurring in the DA systems from the Ak mouse brains, we performed immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent cleared organs, or iDISCO+ clearing method. We resolved catecholaminergic nuclei at the single-cell resolution to determine other brain regions and systems affected upon Pitx3 deficiency and DA loss. iDISCO+ revealed region-specific impairments in Ak mouse brains that could explain the occurrence of pre-motor symptoms in this model. Our results contribute to the understanding of the Ak mouse as a PD model and to determine the neuronal vulnerabilities underlying the main PD co-morbidities.Funded by Spanish Ministries of Science and Innovation (PID2019-111693RB-I00 and PID2019-108851RB-C21) and UE (H2020-SC1-BHC-2018-2020, grant agreement n° 848002 and by NextGeneration EU/PRTR (MICIN/CSIC/PTI+ NeuroAging).Peer reviewe

Regionally selective knockdown of astroglial glutamate transporters in infralimbic cortex induces a depressive phenotype in mice

Elevation of energy metabolism and disturbance of astrocyte number/function in the ventral anterior cingulate cortex (vACC) contributes to the pathophysiology of major depressive disorder (MDD). Functional hyperactivity of vACC may result from reduced astrocytic glutamate uptake and increased neuronal excitation. Here we tested this hypothesis by knocking‐down astrocytic glutamate transporter GLAST/GLT‐1 expression in mouse infralimbic (IL, rodent equivalent of vACC) or prelimbic (PrL) cortices using RNAi strategies. Unilateral siRNA (small interfering RNA) microinfusion targeting GLAST or GLT‐1 in mouse IL induced a moderate (20–30%) and long‐lasting (7 days) decrease in their expression. Intra‐IL GLAST‐/GLT‐1 siRNA microinfusion reduced the number of glial fibrillary acidic protein (GFAP)‐positive and glutamine synthetase (GS)‐positive astrocytes and evoked a depressive‐like phenotype reversed by citalopram and ketamine. Intra‐IL GLAST or GLT‐1 knockdown markedly reduced serotonin (5‐HT) release in the dorsal raphe nucleus (DR) and induced an overall reduction of brain‐derived neurotrophic factor (BDNF) expression in ipsilateral and contralateral hemispheres. Egr‐1 (early growth response protein‐1) labeling suggests that both siRNAs enhance the GABAergic tone onto DR 5‐HT neurons, leading to an overall decrease of 5‐HT function, likely related to the widespread reduction on BDNF expression. Conversely, similar reductions of GLAST and GLT‐1 expression in PrL did not induce a depressive‐like phenotype. These results suggest that a focal glial change in IL translates into global change of brain activity by virtue of the descending projections from IL to DR and the subsequent attenuation of serotonergic function in forebrain, an effect perhaps related to the varied symptomatology of MDD.This study was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, SAF2015‐68346‐P (F.A.) and SAF2016‐75797‐R (A.B.); Retos‐Colaboración Subprogram RTC‐2015‐3309‐1 (A.B.) cofinanced by the European Regional Development Fund “A way to build Europe”. Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM) and CERCA Programme/Generalitat de Catalunya is also acknowledged. N.F. is a recipient of a fellowship from Spanish Ministry of Education, Culture, and Sport.Peer reviewe

APOE E4 allele, along with G206D-PSEN1 mutation, alters mitochondrial networks and their degradation in Alzheimer's disease

Introduction Alzheimer's disease remains the most common neurodegenerative disorder, depicted mainly by memory loss and the presence in the brain of senile plaques and neurofibrillary tangles. This disease is related to several cellular alterations like the loss of synapses, neuronal death, disruption of lipid homeostasis, mitochondrial fragmentation, or raised oxidative stress. Notably, changes in the autophagic pathway have turned out to be a key factor in the early development of the disease. The aim of this research is to determine the impact of the APOE allele E4 and G206D-PSEN1 on the underlying mechanisms of Alzheimer's disease. Methods Fibroblasts from Alzheimer's patients with APOE 3/4 + G206D-PSEN1 mutation and homozygous APOE E4 were used to study the effects of APOE polymorphism and PSEN1 mutation on the autophagy pathway, mitochondrial network fragmentation, superoxide anion levels, lysosome clustering, and p62/SQSTM1 levels. Results We observed that the APOE allele E4 in homozygosis induces mitochondrial network fragmentation that correlates with an increased colocalization with p62/SQSTM1, probably due to an inefficient autophagy. Moreover, G206D-PSEN1 mutation causes an impairment of the integrity of mitochondrial networks, triggering high superoxide anion levels and thus making APOE 3/4 + PSEN1 fibroblasts more vulnerable to cell death induced by oxidative stress. Of note, PSEN1 mutation induces accumulation and clustering of lysosomes that, along with an increase of global p62/SQSTM1, could compromise lysosomal function and, ultimately, its degradation. Conclusion The findings suggest that all these modifications could eventually contribute to the neuronal degeneration that underlies the pathogenesis of Alzheimer's disease. Further research in this area may help to develop targeted therapies for the treatment of Alzheimer's disease.This work was supported by grants from the Spanish Ministries of Science and Innovation (SAF2016-78207 and PID2019-111693RB-I00), from the European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Program (AND-PD, grant agreement n◦ 848,002), and by Next Generation EU/PRTR (MICIN/CSIC/PTI+ NeuroAging), Health, Social Services and Equality (PI2019/09-3) and CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III (CB06/05/0055, CB06/05/0065, PI2013/01-6, PI2015-2/02-5, and PI2015-2/02-4

Mitochondria–lysosome membrane contacts are defective in GDAP1-related Charcot–Marie–Tooth disease

Mutations in the GDAP1 gene cause Charcot–Marie–Tooth (CMT) neuropathy. GDAP1 is an atypical glutathione S-transferase (GST) of the outer mitochondrial membrane and the mitochondrial membrane contacts with the endoplasmic reticulum (MAMs). Here, we investigate the role of this GST in the autophagic flux and the membrane contact sites (MCSs) between mitochondria and lysosomes in the cellular pathophysiology of GDAP1 deficiency. We demonstrate that GDAP1 participates in basal autophagy and that its depletion affects LC3 and PI3P biology in autophagosome biogenesis and membrane trafficking from MAMs. GDAP1 also contributes to the maturation of lysosome by interacting with PYKfyve kinase, a pH-dependent master lysosomal regulator. GDAP1 deficiency causes giant lysosomes with hydrolytic activity, a delay in the autophagic lysosome reformation, and TFEB activation. Notably, we found that GDAP1 interacts with LAMP-1, which supports that GDAP1–LAMP-1 is a new tethering pair of mitochondria and lysosome membrane contacts. We observed mitochondria–lysosome MCSs in soma and axons of cultured mouse embryonic motor neurons and human neuroblastoma cells. GDAP1 deficiency reduces the MCSs between these organelles, causes mitochondrial network abnormalities, and decreases levels of cellular glutathione (GSH). The supply of GSH-MEE suffices to rescue the lysosome membranes and the defects of the mitochondrial network, but not the interorganelle MCSs nor early autophagic events. Overall, we show that GDAP1 enables the proper function of mitochondrial MCSs in both degradative and nondegradative pathways, which could explain primary insults in GDAP1-related CMT pathophysiology, and highlights new redox-sensitive targets in axonopathies where mitochondria and lysosomes are involved.Peer ReviewedPostprint (author's final draft