Amino Acid Availability Controls TRB3 Transcription in Liver through the GCN2/eIF2α/ATF4 Pathway

In mammals, plasma amino acid concentrations are markedly affected by dietary or pathological conditions. It has been well established that amino acids are involved in the control of gene expression. Up to now, all the information concerning the molecular mechanisms involved in the regulation of gene transcription by amino acid availability has been obtained in cultured cell lines. The present study aims to investigate the mechanisms involved in transcriptional activation of the TRB3 gene following amino acid limitation in mice liver. The results show that TRB3 is up-regulated in the liver of mice fed a leucine-deficient diet and that this induction is quickly reversible. Using transient transfection and chromatin immunoprecipitation approaches in hepatoma cells, we report the characterization of a functional Amino Acid Response Element (AARE) in the TRB3 promoter and the binding of ATF4, ATF2 and C/EBPβ to this AARE sequence. We also provide evidence that only the binding of ATF4 to the AARE plays a crucial role in the amino acid-regulated transcription of TRB3. In mouse liver, we demonstrate that the GCN2/eIF2α/ATF4 pathway is essential for the induction of the TRB3 gene transcription in response to a leucine-deficient diet. Therefore, this work establishes for the first time that the molecular mechanisms involved in the regulation of gene transcription by amino acid availability are functional in mouse liver

Intérêt des essais interlaboratoires dans la validation d’un indicateur national de suivi épidémiologique de l’épidémie de SARS-CoV-2 par les eaux usées (en France)

Introduction et objectifs  Le consortium Obépine (Observatoire épidémiologique dans les eaux usées) a développé un outil de surveillance épidémiologique de la circulation du SARS-CoV-2 dans les eaux usées. Cet outil est un indicateur basé sur la quantification du virus dans les eaux usées prélevées dans 168 stations couvrant le territoire national et l’outre-mer, par un réseau de laboratoires. L’utilisation opérationnelle, dans la surveillance épidémiologique de l’épidémie, de l’indicateur de tendances construit selon des modèles mathématiques nécessite de s’assurer que les laboratoires du réseau sont en capacité de rendre des résultats homogènes et justes. L’organisation de comparaisons inter-laboratoires (CIL) est un moyen permettant de s’en assurer. Dans le cadre du réseau OBEPINE trois CIL ont été réalisées, seul le dernier fait l’objet de cette présentation. Matériels et Méthodes Cinq échantillons d'eau usée identiques et naturellement contaminés par du SARS-CoV-2 ont été envoyés aux laboratoires participants, ainsi qu’un sixième non contaminé afin de vérifier la spécificité des méthodes appliquées. Chacun des laboratoires a été évalué selon deux paramètres : la fidélité et la justesse respectivement évaluées par la statistique k de Mendel et le score Z. En l'absence méthode normalisée, les participants ont appliqué l’approche quantitative utilisée au sein de leur laboratoire. Les séquences cibles de la RT-qPCR pour cet essai étaient le gène RdRp IP4, le gène CoV E. Résultats, discussion et conclusion Vingt-trois laboratoires ont participé à l’essai. Les valeurs assignées (calculées à partir des résultats de l’ensemble des participants) étaient de 4,79 et 4,67 unités Log cRNA/L respectivement pour le gène RdRp IP4 et le gène CoV E. Pour le gène RdRp IP4, huit laboratoires ont obtenu des résultats non satisfaisants et deux laboratoire des résultats discutables. Pour le gène CoV E, cinq laboratoires ont obtenu des résultats non satisfaisants et deux laboratoire des résultats discutables. Un laboratoire a détecté le virus dans l’échantillon négatif. La majorité des résultats non satisfaisants est liée à un problème de fidélité (dispersion importante des valeurs obtenues par le laboratoire pour un même échantillon). Un travail pour identifier et comprendre l’origine des différences entre laboratoires a été initié. L’amélioration de la performance des laboratoires passe également par la standardisation de la méthode (normalisation).

Cellular adaptation to amino acid availability: mechanisms involved in the regulation of gene expression

International audienceIn mammals, the impact of nutrients on gene expression has become an important area of research. Nevertheless, the current understanding of amino acid-dependent control of gene expression is limited. Amino acids have multiple and important roles, so their homeostasis has to be finely maintained. However, the blood amino acid content can be affected by certain nutritional conditions or various forms of pathology. It follows that mammals have to adjust several of their physiological functions involved in the adaptation to amino acid availability by regulating expression of numerous genes. The aim of this review is to examine the role of amino acids in regulating mammalian gene expression and physiological functions. A limitation for several individual amino acids strongly increases the expression of target genes such as insulin-like growth factor-binding protein1 (IGFBP-1), C/EBP homologous protein (CHOP) and asparagine synthetase (ASNS) genes. The molecular mechanisms involved in the regulation of CHOP and ASNS gene transcription in response to amino acid starvation have been partly identified. In particular, a signalling pathway requiring the protein kinase general control non-derepressive 2 (GCN2) and the activating transcription factor 4 (ATF4) has been described as sensing the amino acid limitation. In the case of an amino acid-imbalanced food source, this pathway has been shown to decrease food intake by activating a neuronal circuit. Taken together, the results discussed in this review demonstrate that amino acids by themselves can act as 'signal' molecules, with important roles in the control of gene expression and physiological functions

SARS-CoV-2 Whole-Genome Sequencing Using Oxford Nanopore Technology for Variant Monitoring in Wastewaters

Since the beginning of the Coronavirus Disease-19 (COVID-19) pandemic, multiple Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mutations have been reported and led to the emergence of variants of concern (VOC) with increased transmissibility, virulence or immune escape. In parallel, the observation of viral fecal shedding led to the quantification of SARS-CoV-2 genomes in wastewater, providing information about the dynamics of SARS-CoV-2 infections within a population including symptomatic and asymptomatic individuals. Here, we aimed to adapt a sequencing technique initially designed for clinical samples to apply it to the challenging and mixed wastewater matrix, and hence identify the circulation of VOC at the community level. Composite raw sewage sampled over 24 h in two wastewater-treatment plants (WWTPs) from a city in western France were collected weekly and SARS-CoV-2 quantified by RT-PCR. Samples collected between October 2020 and May 2021 were submitted to whole-genome sequencing (WGS) using the primers and protocol published by the ARTIC Network and a MinION Mk1C sequencer (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, United Kingdom). The protocol was adapted to allow near-full genome coverage from sewage samples, starting from ∼5% to reach ∼90% at depth 30. This enabled us to detect multiple single-nucleotide variant (SNV) and assess the circulation of the SARS-CoV-2 VOC Alpha, Beta, Gamma, and Delta. Retrospective analysis of sewage samples shed light on the emergence of the Alpha VOC with detection of first co-occurring signature mutations in mid-November 2020 to reach predominance of this variant in early February 2021. In parallel, a mutation-specific qRT-PCR assay confirmed the spread of the Alpha VOC but detected it later than WGS. Altogether, these data show that SARS-CoV-2 sequencing in sewage can be used for early detection of an emerging VOC in a population and confirm its ability to track shifts in variant predominance

Identification des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance des cellules à une carence en acides aminés

Cette année les assises sont en partenariat avec le Pôle de compétitivité Lyonbiopôle et le cluster Nutravita, des symposiums thématiques portant sur les interactions entre la recherche académique, l’innovation et l’industrie seront proposésLes cellules tumorales situées au coeur de tumeur sont soumises à une forte carence en nutriments et seules les cellules développant des mécanismes de résistance à ces carences vont pouvoir survivre. Les acides aminés (AA) sont particulièrement limitants du fait que certains AA ne peuvent pas être synthétisés de novo par la cellule. Dans un premier temps, face à un déficit en AA, la cellule va pouvoir s’adapter via la modulation de deux voies de signalisation: mTORC1 et GCN2/eIF2α/ATF4. Néanmoins cette adaptation ne peut être que transitoire, si le déficit perdure une sélection génétique des cellules acquérant des mécanismes de résistance peut s’opérer. Afin d’identifier ces mécanismes de résistance de cellules à un déficit prolongé en AA, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en AA pendant plusieurs mois ce qui a amené à la génération de clones capables de survire dans ce milieu. Contrairement aux cellules parentales, les clones ont la capacité de proliférer en milieu carencé en AA et de résister à la mort cellulaire induite par ce milieu. L’étude des voies de signalisation régulées par les AA a mis en évidence que malgré la phosphorylation d’eIF2α, le niveau d’expression d’ATF4 dans les clones est significativement plus faible que celui des cellules parentales. Cette sous-expression se traduit par un défaut d’expression des gènes cibles d’ATF4 dans les clones. L’étude de 2 lignées tumorales a mis en évidence une altération de la voie GCN2/eIF2α/ATF4 dans la lignée présentant la plus forte capacité de résistante à la carence en AA. Il n’existe pas de consensus dans la littérature quant au rôle de la voie GCN2/eIF2α/ATF4 en faveur de la survie ou la mort des cellules. Si la phosphorylation d’eIF2α ne semble pas délétère pour la survie, nos données suggèrent que l’expression d’ATF4 serait défavorable à la survie. D’autres expériences sont en cours afin de mieux caractériser le rôle de cette voie dans la survie des clone