Practical guide for preparation, computational reconstruction and analysis of 3D human neuronal networks in control and ischaemic conditions

To obtain commensurate numerical data of neuronal network morphology in vitro, network analysis needs to follow consistent guidelines. Important factors in successful analysis are sample uniformity, suitability of the analysis method for extracting relevant data and the use of established metrics. However, for the analysis of 3D neuronal cultures, there is little coherence in the analysis methods and metrics used in different studies. Here, we present a framework for the analysis of neuronal networks in 3D. First, we selected a hydrogel that supported the growth of human pluripotent stem cell-derived cortical neurons. Second, we tested and compared two software programs for tracing multi-neuron images in three dimensions and optimized a workflow for neuronal analysis using software that was considered highly suitable for this purpose. Third, as a proof of concept, we exposed 3D neuronal networks to oxygen-glucose deprivation- and ionomycin-induced damage and showed morphological differences between the damaged networks and control samples utilizing the proposed analysis workflow. With the optimized workflow, we present a protocol for preparing, challenging, imaging and analysing 3D human neuronal cultures.publishedVersionPeer reviewe

Effect of cell culture media on extracellular vesicle secretion from mesenchymal stromal cells and neurons

Publisher Copyright: © 2022Background: Extracellular vesicles (EVs) secreted by neuronal cells in vitro have promising therapeutic potential for brain diseases. Optimization of cell culture conditions and methodologies for high-yield isolation of EVs for preclinical and clinical applications, however, remains a challenge. Objective: To probe the cell culture conditions required for optimal EV secretion by human-derived neuronal cells. Methodology: First, we optimized the EV purification protocol using human mesenchymal stromal cell (MSC) cultures. Next, we compared the effects of different variables in human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neuronal cultures on EV secretion. EVs were isolated from cell conditioned media (CCM) and control media with no cells (NCC) using ultrafiltration combined with size-exclusion chromatography (SEC). The hPSC neurons were cultured in 2 different media from which EVs were collected at 2 maturation time-points (days 46 and 60). Stimulation with 25 mM KCl was also evaluated as an activator of EV secretion by neurons. The collected SEC fractions were analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA), protein concentration assay, and blinded transmission electron microscopy (TEM). Results: A peak in cup-shaped particles was observed in SEC fractions 7–10 of MSC samples, but not corresponding media controls, indicating successful isolation of EVs. Culture medium had no significant effect on EV yield. The EV yield of the samples did not differ significantly according to the culture media used or the cell maturation time-points. Stimulation of neurons with KCl for 3 h reduced rather than increased the EV yield. Conclusions: We demonstrated successful EV isolation from MSC and neuronal cells using an ultrafiltration-SEC method. The EV yield from MSC and neuronal cultures exhibited a large batch effect, apparently related to the culture media used, highlighting the importance of including NCC as a negative control in all cell culture experiments.Peer reviewe

Orgaanisten lannoitevalmisteiden varastointi, levittäminen ja annostelu

Biolaitokset käsittelevät huomattavia määriä biomassoja ympäri vuoden, mutta niistä jalostettavien lannoitevalmisteiden käyttö on mahdollista vain kasvukauden aikana. Tuotteiden varastointi valmistuksesta käyttöön on biolaitoksille ongelma ja toisaalta niiden varastointi on ongelma myös viljelijöille. Hankkeen tavoitteena oli saada tietoa orgaanisten maanparannusaineiden patteroinnista syntyvistä valumista ja selvittää keinot, joilla mahdollinen ympäristönkuormitus voidaan estää. Orgaanisten maanparannusaineiden kuljetukseen liittyy kiinteänä osana kuormaus ja purku sekä varastointi, joka tapahtuu täysin eri tavoin kiinteiden tai nestemäisten materiaalien kohdalla. Ympäristön kannalta kestävä mutta kustannuksiltaan kohtuullinen peltopatterointi ja logistiikka vaativat selvitystyötä ja malliratkaisujen tarjoamista yleiseen käyttöön. Orgaanisten lannoitevalmisteiden oikeista levitystekniikoista ja oikeasta annostelusta viljelykäytössä on ollut epäselvyyttä. Tarvittiin tietoa eri levityslaitteiden soveltuvuudesta orgaanisille lannoitevalmisteille ja ohjeita laitteiden oikeista säädöistä. Orgaanisten tuotteiden käyttömäärää rajoittavat yleensä nitraattiasetuksen kokonaistypen levitysraja 170 kg/ha, jos raaka-aineena on yli 10 % lantaa, ja ympäristökorvauksen fosforilannoitusrajat, jos tila kuuluu siihen. Joskus käyttömäärää on voinut rajoittaa lannoitevalmistelain haitallisten metallien hehtaarikohtainen kuormitusraja. Liukoisen typen tarkka annostelu on erittäin tärkeää hyvän sadon määrän ja laadun kannalta. Liukoisen typen määrän ja sen käyttökelpoisuuden vaihtelu orgaanisissa lannoitevalmisteissa tuovat suuria haasteita oikean annoksen ja riittävän hyvän levitystasaisuuden saavuttamiselle. Sopivan suhteen löytäminen orgaanisesta tuotteesta ja täydennyslannoituksesta tulevan liukoisen typen määrille on kompromissi levityskustannusten ja tuotantovaikutuksen välillä. Käytännölliset ohjeet orgaanisten tuotteiden levitystekniikkaan ja käyttöön ovat tarpeellisia viljelijöiden, tuotevalmistajien ja lannoitevalmisteiden tulevan kysynnän kannalta. Tavoitteena oli määrittää erilaisille orgaanisille lannoitevalmistetyypeille soveltuvat levitystekniikat, käyttötavat, logistiikka ja peltopatterointi. Hanketta toteutettiin neljällä ELY-alueella: Kaakkois-Suomi, Etelä-Pohjanmaa, Pohjois-Pohjanmaa ja Uusimaa. Kaakkois-Suomessa esimerkkituotteena oli termofiilisen prosessin mädätysjäännös. Etelä-Pohjanmaalla esimerkkituotteena oli puhdistamolietteen ja biojätteen mesofiilisen mädätysprosessin jäännöksestä termisesti pelletöity maanparannusrae (tyyppinimi kuivarae tai -jauhe). Pohjois-Pohjanmaalla esimerkkituotteena oli Kemicond-käsittelyllä kemiallisesti hapetettu puhdistamoliete. Kenttäkokeissa oli mukana myös lietepohjainen kuivarae. Uudellamaalla esimerkkituotteena oli lietepohjainen maanparannuskomposti. Patteroinnit alkoivat talvella pellon routaannuttua ja päättyivät keväällä. Peltovarastointi aiheutti liukoisen typen pitoisuuden nousun vain peltopatterin kohdalla olevassa maassa. Patterien purkamisen aikaan maan pintakerrosten ammoniumtyppi oli kohonnut korkeintaan 30 cm syvyydessä patterin alla. Ammoniumtyppi voi kasvukauden aikana muuntua huuhtoutumiselle alttiiksi nitraattitypeksi, joten typen siirtymistä patterin alla oleviin maakerroksiin on ehkäistävä. Pistekuormitus voidaan minimoida auman rakenteellisilla ratkaisuilla. Orgaaninen nestettä ja ammoniumtyppeä sitova pohjakerros lannoitevalmisteen alla voi sitoa ravinteita maahan valuvasta nesteestä. Yksi mahdollinen ratkaisu voi olla myös lannoitevalmisteen väliaikaisvarastointi ja typpipitoisen nesteen ”valutus” valmistuslaitoksella. Pellolla varastoitavan maanparannusaineen kuiva-aineen tulee 1.4. voimaan tulleen Nitraattiasetuksen (VnA 1250/2014) mukaan olla yli 30 prosenttia. Täsmällinen ja ajantasainen tuoteseloste on viljelyssä tärkeä työkalu. Tasainen kuiva-ainepitoisuus on erityisesti levittämisen yhteydessä tärkeää, koska se vaikuttaa levityskuvioon. Levitysmenetelmiä valittaessa on huomioitava orgaanisen lannoitevalmisteen raekoko, kosteus ja tasalaatuisuus sekä valittava levityskalusto sopivaksi kyseiselle materiaalille. Levityskaluston käyttöä on syytä harjoitella juuri kyseisellä tuotteella tai jopa kyseisellä tuote-erällä. Kiinteän maanparannusaineen tasainen levitys onnistuu yleensä sitä paremmin mitä kuivempaa ja tasalaatuisempaa levitettävä massa on. Tasainen levitys on tärkeää, jotta liukoisen typen annos on tasainen ja sato valmistuu tasaisesti. Tasainen levitys voi viedä enemmän aikaa, mutta huolimattomasti levitetyt suuret massat tuovat enemmän vaikeuksia kuin tyytyväisiä asiakkaita. Orgaanisten lannoitevalmisteiden annostelussa on yleensä syytä keskittyä liukoisen typen oikeaan annokseen. Orgaanisen liukenemattoman typen satovaikutus on useimmiten vähäinen. Muiden ravinteiden satovaikutuksen tarkastelu ei ole orgaanisten lannoitevalmisteiden käytön yhteydessä mielekästä, koska typen vaikutus peittää alleen muiden ravinteiden vaikutuksen. Liukoisen typen pitoisuus orgaanisissa lannoitevalmisteissa vaihtelee paljon. Lisäksi typen liukoisuus vaihtelee orgaanisen lannoitevalmisteen lähtömateriaalin mukaan, joten tuotteiden välinen vertailu on haastavaa. Tiettyjen kuivien tuotteiden osalta orgaanisten lannoitevalmisteiden annostelua kannattaa tarkastella liukoisen typen lisäksi myös kokonaistyppipohjalta. Tällaisia eläinperäisiä, muusta kuin lannasta valmistettuja, lannoitevalmisteita ovat esimerkiksi maitopohjainen kuivarae ja lihaluujauho-pohjaiset tuotteet. Näissä tuotteissa liukenematon orgaaninen typpi mineralisoituu kasvukauden kuluessa niin nopeasti, että viljelykasvit ehtivät hyötyä niistä. Orgaanisten maanparannusaineiden sopiva levitysmäärä on noin 20 t/ha (lukuun ottamatta kuivarakeita ja -jauheita). Suurin sallittu levitysmäärä määräytyy yleensä kokonaistyppipitoisuuden perusteella niin, että kerta-annos on 170 kg/ha kokonaistyppeä, vaikka kyseinen ns. nitraattiasetuksen raja ei enää lietetuotteita koskekaan. Jos fosforimäärä tai haitallisten metallien kuormitus ei mahdu sallittuihin rajoihin viiden vuoden tasausjakso huomioon ottaen, alennetaan levitysmäärää. Kun tämä sallittu ja järkevä taso on löytynyt, pidetään mieluummin välivuosia kuin pienennettään annosta. Kylvön yhteydessä annettavan täydennystyppiannoksen määrän kannattaa usein olla vähintään 60 kg/ha, jos liukoisen typen tavoitetaso on luokkaa 100 kg/ha ja maanparannusaineen liukoisen typen pitoisuus on matala. Mikäli maanparannusaineessa on runsaasti liukoista typpeä (esim. 3-4 kg/t), kannattaa silloinkin tavoitella käytännössä toimivaa levitysmäärää (noin 20 t/ha) ja täydentää kylvölannoituksessa tarvittava typpimäärä, mikäli liukoisen typen sallittu käyttömäärä sen mahdollistaa. Tätä pienemmät levitysmäärät olisivat käytännössä hankalia levittää. Myös logistiset kustannukset (kuljetukset, organisointi) kasvavat tuoteyksikköä kohti yksittäisten kohteiden levitysmäärien pienentyessä. Kuivarakeiden tai -jauheiden sopiva käyttömäärä on kokonaistypen perusteella noin 5 t/ha. Fosforirajat saattavat kuitenkin helposti ylittyä tällä levitysmäärällä, jos lohkon fosforiluku on välttävä tai sitä korkeampi. Kuivarakeiden levitykseen sopivat lähinnä kalkinlevittimet. Tavanomaisten mineraalilannoitteiden levittämiseen tarkoitetut keskipakoislevittimet eivät yleensä ole tarpeeksi kestäviä näille tuotteille, ja ne on suunniteltu selvästi pienemmille mineraalilannoitteiden levityksessä käytettäville levitysmäärille. Peltokäytön uudet säännökset Nitrattiasetuksessa ja Ympäristökorvausjärjestelmässä aiheuttavat haasteita kierrätysravinnetuotteiden käytölle keväällä 2015. Sallitut fosforin käyttömäärät peltoviljelyssä tiukentuvat sekä fosforin levitysmäärien että kokonaisfosforin käyttökelpoisuuden osalta, jolloin lietepohjaisten tuotteiden käyttö ja kysyntä muuttuu väistämättä. Tarvitaan edelleen tietoisia kehittämistoimia, jotta kierrätysravinteiden käyttö on tulevaisuudessa kestävää ja mielekästä toimijoiden kannalta.201

Predictive Values of Serum Chlamydia trachomatis TroA and HtrA IgG Antibodies as Markers of Persistent Infection in the Detection of Pelvic Adhesions and Tubal Occlusion

Chlamydia trachomatis IgG antibody testing (CAT) has been used as a screening test for tubal factor infertility (TFI), but as the CAT is only a marker of a past exposure to C. trachomatis and not of late sequelae, the positive predictive value (PPV) of the test is low. The persistence of C. trachomatis in the upper genital tract has been suggested as one of the key mechanisms in the development of TFI. Serum antibodies against C. trachomatis TroA and HtrA, proteins expressed specifically during persistent infection, have been suggested as novel biomarkers for TFI diagnostics. We studied serum IgG antibody responses against C. trachomatis TroA, HtrA and MOMP in 79 subfertile women, of whom 28 had laparoscopically proven TFI. We confirmed that the accuracy of CAT in diagnosing TFI is low, whereas TroA IgG and HtrA IgG are more accurate tests in detecting tubal occlusion and pelvic adhesions. However, the sensitivity and negative predictive value (NPV) of TroA IgG and HtrA IgG are still too low to justify their use as a screening test in clinical practice. Individual immunogenetic profiles combined with TroA and HtrA antibody responses might identify women with the highest risk for developing late complications after C. trachomatis infection

Predictive Values of Serum Chlamydia trachomatis TroA and HtrA IgG Antibodies as Markers of Persistent Infection in the Detection of Pelvic Adhesions and Tubal Occlusion

Chlamydia trachomatis IgG antibody testing (CAT) has been used as a screening test for tubal factor infertility (TFI), but as the CAT is only a marker of a past exposure to C. trachomatis and not of late sequelae, the positive predictive value (PPV) of the test is low. The persistence of C. trachomatis in the upper genital tract has been suggested as one of the key mechanisms in the development of TFI. Serum antibodies against C. trachomatis TroA and HtrA, proteins expressed specifically during persistent infection, have been suggested as novel biomarkers for TFI diagnostics. We studied serum IgG antibody responses against C. trachomatis TroA, HtrA and MOMP in 79 subfertile women, of whom 28 had laparoscopically proven TFI. We confirmed that the accuracy of CAT in diagnosing TFI is low, whereas TroA IgG and HtrA IgG are more accurate tests in detecting tubal occlusion and pelvic adhesions. However, the sensitivity and negative predictive value (NPV) of TroA IgG and HtrA IgG are still too low to justify their use as a screening test in clinical practice. Individual immunogenetic profiles combined with TroA and HtrA antibody responses might identify women with the highest risk for developing late complications after C. trachomatis infection

Predicting tubal factor infertility by using markers of humoral and cell-mediated immune response against Chlamydia trachomatis

Problem: The accuracy of Chlamydia trachomatis antibody test in predicting tubal factor infertility (TFI) is limited, and more accurate methods are needed. Cell-mediated immune response (CMI) is crucial in the resolution of pathogen, but it may play an important role in the pathogenesis of C trachomatis-associated tubal damage. We studied whether combining the markers of C trachomatis-induced CMI to humoral immune response improves the accuracy of serology in TFI prediction. Method of study: Our prospective study consists of 258 subfertile women, of whom 22 (8.5%) had TFI. Women with other causes for subfertility served as a reference group. Serum C trachomatis major outer membrane protein (MOMP) and chlamydial heat-shock protein 60 (cHSP60) IgG antibodies were measured by ELISA. CMI was studied by lymphocyte proliferation assay in vitro. Results: Serological markers were more prevalent in women with TFI than in other subfertile women (40.9% vs 12.3% for MOMP IgG and 27.3% vs 10.2% for cHSP60 IgG). The best test combination for TFI was C. trachomatis MOMP and cHSP60 antibody with an accuracy of 90.3%, sensitivity of 22.7% and specificity of 96.6%. Positive post-test probability of this combination was 54.2%, and negative post-test probability was 12.4%. Adding of the markers of CMI did not significantly improve the accuracy of serology in TFI prediction. Conclusion: The accuracy of TFI prediction increases when the combination of C trachomatis MOMP and cHSP60 antibody tests is used. C trachomatis-induced CMI was common in our study population, but the markers of CMI did not predict TFI.Peer reviewe

Predictive Values of Serum Chlamydia trachomatis TroA and HtrA IgG Antibodies as Markers of Persistent Infection in the Detection of Pelvic Adhesions and Tubal Occlusion

Chlamydia trachomatis IgG antibody testing (CAT) has been used as a screening test for tubal factor infertility (TFI), but as the CAT is only a marker of a past exposure to C. trachomatis and not of late sequelae, the positive predictive value (PPV) of the test is low. The persistence of C. trachomatis in the upper genital tract has been suggested as one of the key mechanisms in the development of TFI. Serum antibodies against C. trachomatis TroA and HtrA, proteins expressed specifically during persistent infection, have been suggested as novel biomarkers for TFI diagnostics. We studied serum IgG antibody responses against C. trachomatis TroA, HtrA and MOMP in 79 subfertile women, of whom 28 had laparoscopically proven TFI. We confirmed that the accuracy of CAT in diagnosing TFI is low, whereas TroA IgG and HtrA IgG are more accurate tests in detecting tubal occlusion and pelvic adhesions. However, the sensitivity and negative predictive value (NPV) of TroA IgG and HtrA IgG are still too low to justify their use as a screening test in clinical practice. Individual immunogenetic profiles combined with TroA and HtrA antibody responses might identify women with the highest risk for developing late complications after C. trachomatis infection.Peer reviewe

Human Neurons Form Axon-Mediated Functional Connections with Human Cardiomyocytes in Compartmentalized Microfluidic Chip

The cardiac autonomic nervous system (cANS) regulates cardiac function by innervating cardiac tissue with axons, and cardiomyocytes (CMs) and neurons undergo comaturation during the heart innervation in embryogenesis. As cANS is essential for cardiac function, its dysfunctions might be fatal; therefore, cardiac innervation models for studying embryogenesis, cardiac diseases, and drug screening are needed. However, previously reported neuron-cardiomyocyte (CM) coculture chips lack studies of functional neuron–CM interactions with completely human-based cell models. Here, we present a novel completely human cell-based and electrophysiologically functional cardiac innervation on a chip in which a compartmentalized microfluidic device, a 3D3C chip, was used to coculture human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons and CMs. The 3D3C chip enabled the coculture of both cell types with their respective culture media in their own compartments while allowing the neuronal axons to traverse between the compartments via microtunnels connecting the compartments. Furthermore, the 3D3C chip allowed the use of diverse analysis methods, including immunocytochemistry, RT-qPCR and video microscopy. This system resembled the in vivo axon-mediated neuron–CM interaction. In this study, the evaluation of the CM beating response during chemical stimulation of neurons showed that hiPSC-neurons and hiPSC-CMs formed electrophysiologically functional axon-mediated interactions.publishedVersionPeer reviewe

Menetelmäkehitystä aivokudoksen mallintamiseen : Ihmisperäisistä kantasoluista erilaistettujen hermoverkkojen kasvatus 3D ympäristöissä

Johdanto: Kudosteknologia on monitieteellinen tutkimusala, jonka pitkän linjan tavoitteena on tuottaa uusia hoitomuotoja sairauksien hoitoon. Kudosteknologiassa yhdistetään biologiaa insinööritieteisiin ja pyritään laboratorio-oloissa luomaan keinotekoisia kudoksenomaisia viljelmiä, joissa soluja kasvatetaan biomateriaali-tukirakenteessa. Tämä väitöskirja keskittyy ihmisen keskushermoston kudosteknologisiin sovelluksiin. Keskushermosto, kuten muutkin kudokset, koostuu solujen lisäksi soluväliaineesta. Keskushermoston soluväliaine on erittäin pehmeä, mutta elastinen rakenne, joka koostuu nanokokoisista säikeistä. Biomateriaalit, joita käytetään viljelmän tukena voivat jäljitellä kohdekudoksen ominaisuuksia tai toimia mekaanisena tukena solujen kasvulle. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli luoda 3D-ympäristö, jota voidaan käyttää solumallin pohjana. Materiaalit ja menetelmät: Tässä väitöskirjatyössä käytettiin ihmisen erittäin monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja hermosoluja. 3D-soluviljelyn tukirakenteina käytettiin joko synteettistä PuraMatrix®-hydrogeeliä tai gellan gum -polysakkaridipohjaista hydrogeeliä. Solujen vastetta hydrogeeleihin tutkittiin kolmella erilaisella tutkimusasetelmalla: 1) viljelemällä soluja hydrogeelin alla, jolloin hydrogeeli geeliytettiin suoraan soluviljelmän päälle, 2) viljelemällä soluja esigeeliytetyn hydrogeelipinnan päällä tai 3) viljelemällä soluja sekoitettuna hydrogeeliin. Hydrogeelien lisäksi kolmiulotteisia hermoverkkoja kasvatettiin käyttämällä tukimateriaalina sylinterimäisiä polymeerikomposiitti mikrorakenteita – mikrotorneja. Solujen kasvua tarkasteltiin fluoresoivien leimojen avulla. Tässä väitöskirjatyössä on käytetty sekä yleisiä kaikkiin soluihin sitoutuvia leimoja että vasta-ainetunnistuksen avulla vain kohdeproteiiniinsa sitoutuvia leimoja. Lisäksi hermosoluviljelmien sähköistä aktiivisuutta tutkittiin mikroelektrodihilaan (microelectrode array, MEA) perustuvalla menetelmällä. Tulokset: Eläviin soluihin sitoutuvat fluoresoivat merkkiaineet osoittautuivat hyväksi tutkimusmenetelmäksi. Menetelmän avulla nähtiin, että kahdesta eri viljelmästä peräisin olevat hermosolut pystyivät muodostamaan yhtenäisen hermoverkon, kun ne yhdistettiin samaan viljelmään. Tämän löydöksen soveltaminen jatkossa voi auttaa tutkimuksissa, joissa pyritään selvittämään solusiirrehoidoissa tarvittavaa hermoverkkojen yhteensulautumista. PuraMatrix®¬-hydrogeelin sisällä viljellyt hermosolut kypsyivät muodoltaan monimuotoisiksi sekä niiden sähköinen signalointi oli hermosoluille tyypillistä. Löydösten valossa PuraMatrix® materiaalina vaikuttaa soveltuvan hyvin hermosolujen viljelyalustaksi. Hermosoluille parhaimmat geelipitoisuudet muodostivat hyvin löyhän geelin, minkä johdosta näytteiden valmistus ja käsittely oli haastavaa. Tämä seikka huonontaa PuraMatrix®-hydrogeelin käytettävyyttä hermokudosmallin tukimateriaalina, vaikka muutoin tulokset ovat erittäin lupaavia. Gellan gum -pohjaisia geelejä apuna käyttäen tutkittiin tukimateriaalin jäykkyyden vaikutusta hermosolujen kasvuun ja yritettiin kartoittaa soluviljelyssä käytettävälle tukimateriaalin ihanteellisia ominaisuuksia. Jäykkyydeltään aivoja vastaava materiaali ei kuitenkaan osoittautunut solukokeissa parhaimmaksi. Tämän perusteella todettiin, että jäykkyyden lisäksi monet muut materiaalin ominaisuudet vaikuttavat solujen kasvuun. Parhaat tulokset saatiin gellan gum -hydrogeelillä, johon oli sekoitettu soluväliaineen proteiinia, laminiinia, lisäämään materiaalin bioaktiivisuutta. Hydrogeelien lisäksi sylinterimäiset polymeerikomposiittimikrotornit osoittautuivat erinomaisiksi alustoiksi pienten kolmiulotteisten hermoverkkojen viljelemiseen. Hermoverkkojen muodostuminen mikrotornien ympärille tapahtui toistettavasti ja hermoverkot noudattelivat mikrotornin rakennetta. Tämä työ tukee ajatusta, jonka mukaan kovista materiaaleista valmistettu tukirakenne on hyvä vaihtoehto laboratoriomallin pohjaksi. Johtopäätökset: Väitöskirjatyön pohjalta voidaan todeta, että ihmisen hermosoluille ihanteellisen tukimateriaalin mekaanisten tai kemiallisten ominaisuuksien kartoittaminen ei ole yksioikoista. Monet tutkimukset keskittyvät tuottamaan monikäyttöisiä materiaaleja keskushermoston sovelluksiin. Tämä on haastavaa, sillä erilaisiin koeasetelmiin tarvitaan hyvin erilaisia ominaisuuksia. Tämän työn pohjalta herääkin kysymys siitä, olisiko parempi keskittyä materiaalin yleisen optimoinnin sijasta optimoimaan sen käyttöä soluviljelyalustana valikoiduissa sovelluksissa. Tämä tarkoittaisi materiaalin valitsemista tutkimuskysymyksen mukaan niin, että materiaalin ominaisuudet tukevat parhaalla mahdollisella tavalla tutkimuksen kohteena olevan ilmiön havaitsemista.Background: This thesis focuses on in vitro tissue engineering (TE) applications for the central nervous system (CNS). TE is a multidisciplinary research field that aims at healing human tissues by developing novel engineered biological constructs. Typically, these constructs are composed of cells in a 3D biomaterial scaffold. One promising research platform for neural TE is the use of human stem cell derived neural cells, combined with a 3D scaffold, as a simplified model system for CNS – an in vitro neural model. The commonly used scaffold materials are brain extracellular matrix (ECM)-mimicking hydrogels or rigid microscale 3D matrices that support cell growth. The main aim of this work was to create a 3D neural culturing setup that could serve as a brain tissue model in the future. Materials and Methods: In this thesis, human pluripotent stem cell-derived neural cells were used. The neural cell cultures were visualized with fluorescent labeling, either using cell-accumulating probes or immunocytochemical labeling. Electrical neuronal network functionality was measured using a microelectrode array (MEA) platform. The hydrogels utilized were PuraMatrix®, a synthetic self-assembling hydrogel, and a natural polysaccharide gellan gum hydrogel crosslinked with spermidine (SPD). In this thesis, hydrogels were studied using three culturing methods: 1) Direct gelation of the hydrogel on top of the pre-cultured cell monolayer (2D); 2) Cells cultured on top of the hydrogel surface (2D); 3) Encapsulated cells cultured within the hydrogel (3D). Rigid tubular microtower scaffolds were polymerized using 2 photon-direct laser writing (2PP-DLW) from a polymer-ceramic hybrid material, Ormocomp. Results: Fluorescent probes were found to be suitable for tracking human neural cells for up to four weeks in culture. Co-cultures from two pre-labeled neural populations formed a homogenous neural network in 2D culture, and the electrical neuronal network activity of these co-cultures was similar to that of the control cultures. Both of the studied hydrogel materials were optimized for human neural cell culturing by testing different hydrogel compositions. Interestingly, sparse hydrogels with low PuraMatrix® dilutions were best for neuronal cells, whereas stiff composition of gellan gum hydrogel supported neural networks better than the softer compositions. Neural networks cultured within the PuraMatrix® hydrogel were also shown to have spontaneous electrical activity. Maturation of neuronal activity was slow in the 3D setup; however, on the other hand, morphological inspection showed in vivo mimicking complexity in the cell morphology. Rigid microtower scaffolds were found to be effective for supporting 3D neural network formation around the scaffold. These neural networks were stable for up to four weeks in culture, even though a slight decrease in cell number was seen at the four-week time point. Conclusions: Both of the studied scaffold types, hydrogels and rigid scaffolds, were suitable as a supporting matrix for the formation of 3D neural networks. Large neural networks randomly formed inside hydrogels and were anisotropic, whereas the networks formed around microtowers were smaller, but more easily controlled with the microtower design. All of the studied scaffold materials have potential in in vitro neural applications, but they are applicable to different study questions