Carbonic Anhydrase II: A Model System for Artificial Copper Center Design, Protein-guided Cycloadditions, Tethering Screenings and Fragment-based Lead Discovery

Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine Auswahl recht verschiedene Ansätze zur Fragment-basierten Leitstruktursuche (fragement-based lead discovery) mit dem Zielprotein Carboanhydrase II durchgeführt. Die verschiedenen Projekte wurden entscheidend durch die Protein Kristallographie unterstützt und methodisch gelenkt. Durch Verbesserung von Strahlungsquellen und der Rechenleistung von Computern hat sich die Protein-Kristallographie in den letzten Jahren zu einem Analytik Instrument entwickelt, welches routinemäßig zur Strukturaufklärung eingesetzt werden kann. Circa 200 bis 250 Datensätze wurden im Rahmen dieser Arbeit gesammelt um Fragestellungen der verschiedenen ambitionierten Projekte mit Focus auf die Strukturbiologie zu beantworten. Wie kann die Wechselwirkung zwischen Proteinen und kleinen Substanzen für Wirkstoffentwicklungen ausgenutzt werden? Ist es möglich, z.B. Reaktionen die in situ ablaufen, durch Protein-Kristallographie zu verfolgen? Kann die Erfolgsquote von Fragment-basierter Kristallographie durch einen Tethering-Ansatz, welcher schwach bindende Fragmente am Protein fixiert, erhöht werden? Die Verfügbarkeit großer Mengen an CA II ist die Grundvoraussetzung um solch eine Bandbreite sehr verschiedener Projekte durchführen zu können. Daher wurde das CA II Gen in das GST gene fusion System kloniert, ein System welches Gen Expression auf sehr hohem Niveau ermöglicht. Das Expressionssystem wurde hinsichtlich der Proteinausbeute optimiert und stellt 30 mg Protein aus 1 L Zellkultur bereit. Etliche CA II Mutanten wurden durch ortsgerichtete Mutation hergestellt und eine Quecksilber-freie Protein-Kristallisation für den Wildtyp und die Mutanten erstellt. Die Durchführung einer prominenten Click-Chemie-Reaktion, der Huisgen Reaktion – eine Cu+ katalysierte 2+3 dipolare Cycloaddition – in der Bindetasche der CA II war das anfängliche Ziel des ersten Projektes dieser Dissertation. Dafür sollte ein künstliches Kupfer-Zentrum an der Oberfläche der CA II eingeführt, und dieses neue katalytische Zentrum für die Bildung von Triazolen aus Alkinen und Aziden ausgenutzt werden. Leider verblieben diese Versuche eines rationalen Designs erfolglos. Dies zeigt auf, dass unser derzeitig noch begrenztes Verständnis über den Zusammenhang zwischen Aminosäure-Mutationen und Proteinarchitektur in komplexen biologischen Systemen, wie z.B. in hoch entwickelten Proteinen, unvorhersehbaren Auswirkungen mit sich bringen kann. Schließlich, eher durch einen glücklichen Zufall als gezieltes Design, konnte die Bildung eines Kupfer-Zentrums an der Oberfläche der CA II zustande gebracht werden. Neben dem zuvor beschriebenen Design eines Metall-Zentrums, wurde das Click-Chemie-Projekt ebenso durch einen neuartigen Tethering-unterstützten Ansatz vorangetrieben. In diesem Ansatz wird eine Reaktionskomponente kovalent an die Proteinoberfläche gebunden, während die zweite Komponente durch einen Sulfonamid-Anker an das Zink-Ion im aktiven Zentrum bindet. Die Reaktion konnte entweder durch Cu+ Ionen oder aber durch die Proteinumgebung ausgelöst werden. Bemerkenswerterweise erfolgte die Protein-induzierte Triazolbildung mit ausgeprägter Regio- sowie Stereoselektivität. Aus dem racemischen Alkingemisch wurde selektiv das 1,5-S-Triazol gebildet. Die Tethering Methode wurde abgesehen von diesem Click-Chemie-Ansatz ebenso für ein Fragment-Screening in Hinblick auf die CA II angewandt. Der Tethering-Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Fragmenten mit eher schwacher Affinität zum Zielprotein. Durch einen computerbasierten Docking-Ansatz wurde eine virtuelle Bibliothek von Fragmenten getestet um so eine überschaubare Anzahl an Substanzen für die Synthese auszuwählen. Durch HPLC-MS Messungen konnten viele Fragmente mit einer vielversprechenden Affinität zu CA II identifiziert werden. Einige dieser Substanzen wurden im kovalenten Komplex mit CA II kristallographisch untersucht und zeigten, dass eine Saccharin-Bindetasche an der Protein-Oberfläche mit diesem Tethering-Ansatz erfolgreich untersucht werden kann. Zusätzlich konnte eine zweite Bindetasche an der Oberfläche, bekannt für die Bindung von CA II Aktivatoren, untersucht werden. In einem weiteren Ansatz zur Fragment-basierten Leitstruktursuche wurden vier neue Zink-koordinierende Kopfgruppen an CA Isoenzymen getestet. Eine Komplexstruktur von CA II mit 1,2-HOPTO zeigte einen neuartigen Zn2+ koordinierenden Bindungsmodus mit Wechselwirkungen zu Thr199 und Thr200. Das Fragment, welches zusätzlich perfekt durch ein Wassernetzwerk koordiniert ist, verspricht eine neue Klasse von CA Inhibitoren. Durch die Addition von Substituenten, die mit den hydrophilen und lipophilen Bereichen der CA II Bindetasche wechselwirken, kann die Bindungsaffinität verbessert werden

Format and implementation of written assessments

Alle Leistungsnachweise des klinischen Studienabschnittes nach neuer Ärztlicher Approbationsordnung müssen benotet werden; hierzu sind in der Regel schriftliche Prüfungen notwendig. Bisher erprobte Methoden beinhalten die Prüfung passiven Wissens (Einfachauswahlfragen, multiple choice-Fragen, progress test-Fragen) und aktiven Wissens (short essay questions, long essay questions). Vor- und Nachteile dieser Verfahren werden diskutiert, sowie die zur Erstellung, Durchführung und Auswertung schriftlicher Prüfungen notwendigen Ressourcen.According to the new German licensing regulations all clinical certificates have to be graded; mostly this requires written tests. Methods tested to date include tests for passive knowledge (single choice questions, multiple choice questions, progress test) and active knowledge (short essay questions, long essay questions). We discuss advantages and disadvantages of these methods, as well as the resources required for test preparation, testing and grading of student answers

Airway responses and inflammation in subjects with asthma after four days of repeated high-single-dose allergen challenge

Background: Both standard and low-dose allergen provocations are an established tool in asthma research to improve our understanding of the pathophysiological mechanism of allergic asthma. However, clinical symptoms are less likely to be induced. Therefore, we designed a protocol for repetitive high-dose bronchial allergen challenges to generate clinical symptoms and airway inflammation. Methods: A total of 27 patients aged 18 to 40 years with positive skin-prick tests and mild asthma underwent repetitive high-dose allergen challenges with household dust mites for four consecutive days. Pulmonary function and exhaled NO were measured at every visit. Induced sputum was analysed before and after the allergen challenges for cell counts, ECP, IL-5, INF-γ, IL-8, and the transcription factor Foxp3. Results: We found a significant decrease in pulmonary function, an increased use of salbutamol and the development of a late asthmatic response and bronchial hyperresponsiveness, as well as a significant induction of eNO, eosinophils, and Th-2 cytokines. Repeated provocation was feasible in the majority of patients. Two subjects had severe adverse events requiring prednisolone to cope with nocturnal asthma symptoms. Conclusions: Repeated high-dose bronchial allergen challenges resulted in severe asthma symptoms and marked Th-2-mediated allergic airway inflammation. The high-dose challenge model is suitable only in an attenuated form in diseased volunteers for proof-of-concept studies and in clinical settings to reduce the risk of severe asthma exacerbations. Trial registration: ClinicalTrials.govNCT0067720

Particulate matter (PM) 2.5 levels in ETS emissions of a Marlboro Red cigarette in comparison to the 3R4F reference cigarette under open- and closed-door condition

Introduction: Potential health damage by environmental emission of tobacco smoke (environmental tobacco smoke, ETS) has been demonstrated convincingly in numerous studies. People, especially children, are still exposed to ETS in the small space of private cars. Although major amounts of toxic compounds from ETS are likely transported into the distal lung via particulate matter (PM), few studies have quantified the amount of PM in ETS. Study aim The aim of this study was to determine the ETS-dependent concentration of PM from both a 3R4F reference cigarette (RC) as well as a Marlboro Red brand cigarette (MRC) in a small enclosed space under different conditions of ventilation to model car exposure. Method: In order to create ETS reproducibly, an emitter (ETSE) was constructed and mounted on to an outdoor telephone booth with an inner volume of 1.75 m3. Cigarettes were smoked under open- and closed-door condition to imitate different ventilation scenarios. PM2.5 concentration was quantified by a laser aerosol spectrometer (Grimm; Model 1.109), and data were adjusted for baseline values. Simultaneously indoor and outdoor climate parameters were recorded. The time of smoking was divided into the ETS generation phase (subset "emission") and a declining phase of PM concentration (subset "elimination"); measurement was terminated after 10 min. For all three time periods the average concentration of PM2.5 (Cmean-PM2.5) and the area under the PM2.5 concentration curve (AUC-PM2.5) was calculated. The maximum concentration (Cmax-PM2.5) was taken from the total interval. Results: For both cigarette types open-door ventilation reduced the AUC-PM2.5 (RC: from 59 400 +/- 14 600 to 5 550 +/- 3 900 mug*sec/m3; MRC: from 86 500 +/- 32 000 to 7 300 +/- 2 400 mug*sec/m3; p < 0.001) and Cmean-PM2.5 (RC: from 600 +/- 150 to 56 +/- 40 mug/m3, MRC from 870 +/- 320 to 75 +/- 25 mug/m3; p < 0.001) by about 90%. Cmax-PM2.5 was reduced by about 80% (RC: from 1 050 +/- 230 to 185 +/- 125 mug/m3; MRC: from 1 560 +/-500 mug/m3 to 250 +/- 85 mug/m3; p < 0.001). In the subset "emission" we identified a 78% decrease in AUC-PM2.5 (RC: from 18 600 +/- 4 600 to 4 000 +/- 2 600 mug*sec/m3; MRC: from 26 600 +/- 7 200 to 5 800 +/- 1 700 mug*sec/m3; p < 0.001) and Cmean-PM2.5 (RC: from 430 +/- 108 to 93 +/- 60 mug/m3; MRC: from 620 +/- 170 to 134 +/- 40 mug/m3; p < 0.001). In the subset "elimination" we found a reduction of about 96-98% for AUC-PM2.5 (RC: from 40 800 +/- 11 100 to 1 500 +/- 1 700 mug*sec/m3; MRC: from 58 500 +/- 25 200 to 1 400 +/- 800 mug*sec/m3; p < 0.001) and Cmean-PM2.5 (RC: from 730 +/- 200 to 27 +/- 29 mug/m3; MRC: from 1 000 +/- 450 to 26 +/- 15 mug/m3; p < 0.001). Throughout the total interval Cmax-PM2.5 of MRC was about 50% higher (1 550 +/- 500 mug/m3) compared to RC (1 050 +/- 230 mug/m3; p < 0.05). For the subset "emission" - but not for the other periods - AUC-PM2.5 for MRC was 43% higher (MRC: 26 600 +/- 7 200 mug*sec/m3; RC: 18 600 +/- 4 600 mug*sec/m3; p < 0.05) and 44% higher for Cmean-PM2.5 (MRC: 620 +/- 170 mug/m3; RC: 430 +/- 108 mug/m3; p < 0.05). Conclusion: This method allows reliable quantification of PM2.5-ETS exposure under various conditions, and may be useful for ETS risk assessment in realistic exposure situations. The findings demonstrate that open-door condition does not completely remove ETS from a defined indoor space of 1.75 m3. Because there is no safe level of ETS exposure ventilation is not adequate enough to prevent ETS exposure in confined spaces, e.g. private cars. Additionally, differences in the characteristics of cigarettes affect the amount of ETS particle emission and need to be clarified by ongoing investigations

Exploring the Applicability of Sinterjoining to Combine Additively Manufactured Ceramic Components

This paper examines the general applicability of sinterjoining for combining the advantages of Ceramic Injection Molding (CIM) and Additive Manufacturing (AM) as well as different AM processes. To do so, the geometric tolerance, the pre-sintering temperature and the co-sintering time are varied exemplarily on samples produced by vat photopolymerization (VPP) to minimize the force required for inserting the bodies and to maximize the degree of sintering. The results show that degrees of sintering larger 90 % can be obtained reproducibly. Thus, sinterjoining can be considered as a promising approach for combining the advantages of several ceramic manufacturing processes

Natural sciences knowledge of first year students in medicine

Gute naturwissenschaftliche Vorkenntnisse sind insbesondere für den vorklinischen Studienabschnitt wichtig. Wegen der heterogenen Auswahl von Leistungskursen und Abituranforderungen kann jedoch nicht unbedingt von einem einheitlichen Wissensstand ausgegangen werden. Daher wurde versucht, mit einem Testbogen aus insgesamt 40 Aufgaben zur Biologie, Chemie, Mathematik und Physik den Wissensstand der Studienanfänger in Humanmedizin in Deutschland zu quantifizieren. Der Fragebogen enthielt neben Faktenaufgaben auch Anwendungen vor allem mathematischer und chemischer Prinzipien. Alle Fragen mussten durch Freitextantworten oder Skizzen beantwortet werden. Teilgenommen haben insgesamt 2 935 Studienanfänger des Wintersemesters 2004/2005 von 14 deutschen Universitäten (etwa 40% des Jahrganges). Im Mittel wurden 14,34 der 40 Aufgaben richtig beantwortet; etwas bessere Kenntnisse wurden in den 15 Biologiefragen (6,89) und den 8 Mathematikfragen erreicht (3,23), während vor allem in Chemie (2,18 von 10 Fragen) und Physik (1,55 von 8 Fragen) große Wissenslücken bestehen. Die Ergebnisse bestätigen, dass die naturwissenschaftlichen Vorkenntnisse der Studienanfänger schlecht sind; sie erfordern einen größeren Zeitaufwand für die Vermittlung des Abiturwissens im ersten vorklinischen Semester. Sinnvoll erscheint alternativ die verpflichtende Teilnahme an Zusatzkursen in diesen Fächern vor Aufnahme des eigentlichen Fachstudiums.Fundamental knowledge in natural sciences is important especially during preclinical studies. In order to graduate with the German "Abitur" students may select major courses; subsequently grading requirements vary among selected major courses and schools. Therefore, a comparable knowledge base among beginning students cannot be assumed. We tried to assess the knowledge base of first year medical students with a test containing a total of 40 questions in biology, chemistry, mathematics and physics. Besides factual knowledge the test also contained the application of principles, especially in mathematics and chemistry. A total of 2 935 students beginning in the winter term 2004/2005 participated from 14 universities (appr. 40% of all newly enrolled students). They answered correctly an average of 14,34 out of 40 questions. Above average results were achieved in biology (6,89 out of 15 questions) and mathematics (3,23 out of 8 questions), whereas major knowledge gaps were present especially in chemistry (2,18 out of 10 questions) and physics (1,55 out of 8 questions). These results confirm that first year students start with a low knowledge base in natural sciences; this requires a major effort by medical faculties to cover topics normally expected to be present after high school graduation (Abitur). Alternatively, the mandatory additional courses covering these topics would be advantageous before the start of medical studies

Do examination results mirror student's preferences?

Poster Während des klinischen Studienabschnittes bildet sich der Eindruck, dass Studierende entweder stärker an eher theoretischen Gebieten wie Innere Medizin, Pharmakologie oder Klinischer Chemie interessiert sind, oder an praktisch orientierten, meist operativen Disziplinen. Wir haben diese Hypothese am Fachbereich Medizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt getestet mit den Prüfungsergebnissen für die Noten in den klinischen Fächern. Die Klausuren werden mit einem vergleichbaren Format in allen Fächern abgehalten, praktische Fähigkeiten werden durch OSCE-Prüfungen gemessen. Die derzeitige Datenbasis umfasst 300 - 1000 Studierende pro Fach. Die derzeitigen Ergebnisse zeigen eine stärkere Korrelation der Prüfungsleistungen in verwandten Fächern; die Korrelationen zwischen theoretischen und praktischen Prüfungsleistungen sind entgegen den Erwartungen nicht stark ausgeprägt. Bei der Interpretation ist zu berücksichtigen, dass die individuellen Leistungen auch durch andere Faktoren beeinflusst werden, wie die Notwendigkeit des Arbeitens, Tätigkeiten im Rahmen einer Dissertation oder extracurriculare Aktivitäten, die die Prioritäten in Klausuren oder praktischen Prüfungen von einer guten Note zum Bestehen ändern können. Auch die derzeitige Unsicherheit über die Bedeutung der Fachnoten trägt dazu bei, nicht in jedem Fall gute Noten erreichen zu wollen. Die derzeitigen Daten zeigen keine ausgeprägte Clusterung studentischer Lernleistungen; typischerweise sind individuelle Studierende entweder in allen Fächern herausragend, oder in keinem Fach