28 research outputs found
Hits and Lead Discovery in the Identification of New Drugs against the Trypanosomatidic Infections
Accelerating Drug Discovery Efforts for Trypanosomatidic Infections Using an Integrated Transnational Academic Drug Discovery Platform
According to the World Health Organization, more than 1 billion people are at risk of or are affected by neglected tropical diseases. Examples of such diseases include trypanosomiasis, which causes sleeping sickness; leishmaniasis; and Chagas disease, all of which are prevalent in Africa, South America, and India. Our aim within the New Medicines for Trypanosomatidic Infections project was to use (1) synthetic and natural product libraries, (2) screening, and (3) a preclinical absorption, distribution, metabolism, and excretion\u2013toxicity (ADME-Tox) profiling platform to identify compounds that can enter the trypanosomatidic drug discovery value chain. The synthetic compound libraries originated from multiple scaffolds with known antiparasitic activity and natural products from the Hypha Discovery MycoDiverse natural products library. Our focus was first to employ target-based screening to identify inhibitors of the protozoan Trypanosoma brucei pteridine reductase 1 (TbPTR1) and second to use a Trypanosoma brucei phenotypic assay that made use of the T. brucei brucei parasite to identify compounds that inhibited cell growth and caused death. Some of the compounds underwent structure-activity relationship expansion and, when appropriate, were evaluated in a preclinical ADME-Tox assay panel. This preclinical platform has led to the identification of lead-like compounds as well as validated hits in the trypanosomatidic drug discovery value chain
Własności dynamiczne miejsca odczytu mRNA w rybosomie oraz jego kompleksów z antybiotykami
Translation process is one of the key processes of life and it occurs in every living cell.
In this process amino acid chains of proteins are synthesized based on the matrix of messenger
ribonucleic acid (mRNA) sequence with the participation of transfer RNA (tRNA). Translation
is performed by ribosomes, which are large macromolecular assemblies of RNA and proteins.
Importantly, this process must proceed with sufficient accuracy, which is ensured by the mRNA
decoding site (A-site) on the ribosome. During elongation of peptide chain, the two flexible
adenines in the A-site mediate interactions between mRNA and tRNA that carries the proper
amino acid. A-site is also a target for aminoglycoside antibiotics, which perturb the mRNA
decoding process in bacteria. This class of compounds is used in hospitals for severe infections.
Unfortunately, aminoglycoside therapy may cause serious adverse effects. One of the reasons is
insufficient specificity of aminoglycosides to their main target; they also bind to the A-site on the
human ribosome. Another problem is that bacteria relatively quickly develop resistance to any
antibacterials, including aminoglycosides. Thus, there is a need for research aimed at improving
the properties of these antibiotics.
In this thesis we applied computational methods to study the A-site physico-chemical properties in the context of the mRNA decoding accuracy and aminoglycoside binding. Since the dynamical aspect is critically important for the mRNA decoding process, we used molecular dynamics
simulation techniques as a main research method. First, we investigated the physico-chemical
properties of the modified oligonucleotides (like peptide nucleic acid) that can be covalently
attached to aminoglycoside. Such chemical compounds can increase selectivity of aminoglycosides by complementary binding to ribosomal RNA in the proximity of the A-site. We found
different conformational preferences of the studied oligonucleotides, which could be useful for the
oligonucleotide-based antibiotic design. Further, we compared physico-chemical properties of the
aminoglycoside targets: the bacterial and human A-site variants, which differ in RNA sequences.
We identified conformational factors explaining the differences in aminoglycoside binding affinities towards the A-site variants and the known different translation accuracies in different life
domains (e.g., human and bacteria). Finally, we investigated resistance mutations in the ribosomal protein S12, which is located proximal to the A-site. The mutations are known to counteract
the bactericidal mechanism of action of aminoglycosides. Based on our data we suggested the
structural mechanisms of the antibiotic deactivation in the mutants.
In conclusion, this work extends the knowledge on the mRNA decoding in bacteria and
human, and on the factors that may affect accuracy of this process. Results of this work also
explain the differences in affinities and activities of aminoglycosides towards the human and
bacterial A-site. In the future this knowledge may help in the design of more effective antibiotics.
Finally, in this thesis we thoroughly discussed the choice of the applied simulation methods,
which may serve as a guide in choosing the proper computational protocols for the studies of the
RNA systems similar to the A-site.Proces translacji jest jednym z najważniejszych procesów życiowych, zachodzących w każdej
żywej komórce. Prowadzi on do syntezy białek na podstawie sekwencji matrycowego kwasu rybonukleinowego (mRNA) i przy udziale transferowego RNA (tRNA). Proces ten jest katalizowany
przez rybosomy, kompleksy makromolekularne zbudowane z kwasu rybonukleinowego i z białek.
Translacja musi zachodzić z odpowiednią dokładnością, aby syntetyzowane łańcuchy peptydowe
miały prawidłową sekwencję. W kontroli dokładności tego procesu jedną z głównych ról odgrywa
miejsce odczytu mRNA w rybosomie (tzw. miejsce A). W miejscu A znajdują się dwie ruchliwe konserwatywne adeniny, które pośredniczą w tworzeniu kompleksu między mRNA i tRNA,
pośrednio zapewniając przyłączenie odpowiedniego aminokwasu do łańcucha peptydowego. Ten
proces może być zaburzony przez wiązanie w miejscu A antybiotyków aminoglikozydowych. Są
one stosowane w szpitalach w przypadku ciężkich infekcji, ale mogą niestety powodować poważne
skutki uboczne, takie jak uszkodzenie słuchu. Jedną z przyczyn jest niska selektywność aminoglikozydów, które wiążą się też z miejscem A w ludzkim rybosomie. Ponadto aminoglikozydy,
podobnie jak inne antybiotyki, stosunkowo szybko wywołują oporność bakterii. Te problemy
stały się motywacją do moich badań.
Wykorzystując symulacje komputerowe, badałam własności fizyko-chemiczne miejsca A w kontekście dokładności procesu odczytu mRNA oraz czynników wpływających na tę dokładność, takich jak antybiotyki. Jako że w badanym procesie niezwykle istotny jest aspekt dynamiczny, podstawową zastosowaną metodą obliczeniową była dynamika molekularna, która pozwala na śledzenie dostępnych konformacji układu w czasie. Najpierw zajęłam się zmodyfikowanymi chemicznie
analogami kwasów nukleinowych, które mogą być kowalencyjnie dołączone do aminoglikozydu,
zwiększając selektywność wiązania antybiotyku i przeciwdziałając niektórym mechanizmom oporności bakterii. Wskazałam własności dynamiczne wybranych oligonukleotydów tłumaczące ich
względnie silne wiązanie do RNA, co może ułatwić projektowanie związków bazujących na oligonukleotydach. Drugim nurtem badań było dokładniejsze poznanie własności fizyko-chemicznych i
strukturalnych miejsca A. W szczególności porównywałam dynamikę jego bakteryjnego i ludzkiego
wariantu, różniących się sekwencją RNA. To pozwoliło na identyfikację czynników konformacyjnych mogących wpłynąć na dokładność procesu odczytu mRNA oraz na różnice w powinowactwie wiązania antybiotyków aminoglikozydowych. Następnie badałam też mechanizmy bakteryjnej oporności na aminoglikozydy, spowodowanej mutacjami w rybosomowym białku S12,
które sąsiaduje z miejscem A. Badania te pozwoliły zaproponować strukturalno-dynamiczne
mechanizmy dezaktywacji aminoglikozydów w wyniku mutacji.
Wyniki moich badań poszerzyły wiedzę na temat mechanizmu odczytu mRNA w rybosomie
u bakterii i u człowieka, oraz czynników które mogą wpływać na jego dokładność. Moje badania
również wskazują na przyczyny różnic w wiązaniu aminoglikozydów do ludzkich i bakteryjnych
wariantów miejsca A. W dalszej perspektywie wiedza ta może się przyczynić do projektowania skuteczniejszych antybiotyków. Ponadto w niniejszej pracy szczegółowo przedyskutowałam
wybór metod, co może wspomóc przyszłe badania nad dynamiką układów złożonych z RNA,
podobnych do miejsca A
Stacking frequency for A1492(h44)•A1493(h44) and A1493(h44)•A1913(H69).
<p>Values are the percentage of time when the adenines are stacked (data are from three trajectories for each variant). The criterion for stacking is given in the ‘<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0111811#s2" target="_blank">Methods</a>’ section; nucleotide numbers are in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0111811#pone-0111811-g001" target="_blank">Fig 1</a>.</p><p>Stacking frequency for A1492(h44)•A1493(h44) and A1493(h44)•A1913(H69).</p
Interplay of the Bacterial Ribosomal A-Site, S12 Protein Mutations and Paromomycin Binding: A Molecular Dynamics Study
<div><p>The conformational properties of the aminoacyl-tRNA binding site (A-site), and its surroundings in the <i>Escherichia coli</i> 30S ribosomal subunit, are of great relevance in designing antibacterial agents. The 30S subunit A-site is near ribosomal protein S12, which neighbors helices h27 and H69; this latter helix, of the 50S subunit, is a functionally important component of an intersubunit bridge. Experimental work has shown that specific point mutations in S12 (K42A, R53A) yield hyper-accurate ribosomes, which in turn confers resistance to the antibiotic ‘paromomycin’ (even when this aminoglycoside is bound to the A-site). Suspecting that these effects can be elucidated in terms of the local atomic interactions and detailed dynamics of this region of the bacterial ribosome, we have used molecular dynamics simulations to explore the motion of a fragment of the <i>E. coli</i> ribosome, including the A-site. We found that the ribosomal regions surrounding the A-site modify the conformational space of the flexible A-site adenines 1492/93. Specifically, we found that A-site mobility is affected by stacking interactions between adenines A1493 and A1913, and by contacts between A1492 and a flexible side-chain (K43) from the S12 protein. In addition, our simulations reveal possible indirect pathways by which the R53A and K42A mutations in S12 are coupled to the dynamical properties of the A-site. Our work extends what is known about the atomistic dynamics of the A-site, and suggests possible links between the biological effects of hyper-accurate mutations in the S12 protein and conformational properties of the ribosome; the implications for S12 dynamics help elucidate how the miscoding effects of paromomycin may be evaded in antibiotic-resistant mutants of the bacterial ribosome.</p></div
MD-derived distributions of glycosidic angles (in deg) for A1492 and A1493.
<p>The <i>anti</i>, <i>high-anti</i> and <i>syn</i> conformational regions are shaded. The data are cumulative from three independent MD trajectories per simulation system variant.</p
Conformations of K42 and K43.
<p>The initial structure is yellow and an exemplary final conformation is colored by atom type. The most frequent H-bonds in the MD trajectories are marked by red dashed lines. Paromomycin is shown as a space-filling vdW representation.</p
Representative MD conformations of A1492 and A1493 in the variants with paromomycin.
<p>Cluster representatives from three MD trajectories (different colors) were superimposed on the crystal structure of the <i>E. coli</i> ribosome bound to mRNA and A-site tRNA <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0111811#pone.0111811-Zhang1" target="_blank">[7]</a> (PDB 3I1Z). Paromomycin is represented as vdW spheres. The numbers of conformational clusters of A1492 and A1493 for each MD run are listed in each panel as an inset (color-coded as simulation numbers in panel [a]); the total number of conformational clusters is given, from clustering of frames from all three independent MD trajectories for a given simulation variant. Violet and orange arrows indicate the general directions taken by S12 and H69, with respect to A1492 and A1493.</p
MD conformations of A1492 and A1493 in the uncomplexed A-site.
<p>Representatives of final clusters (with occupancies in %) are shown for each simulation run (#1, #2 and #3), in the variants without paromomycin. The h44 helix is shown in green, S12 (above h44) and H69 (below) are grey, A1492 is pink, and A1493 is purple. K42, K43 (S12), A1492 and A1493 (h44), and A1913 and C1914 (H69) are rendered as sticks (hydrogens are not shown). The number of computed structural clusters across all frames (aggregated over all three trajectories of each simulation variant) is shown in red, after the variant label.</p
Glycosidic angles of A1492 versus A1493, derived from crystal structures of bacterial ribosomes, with and without A-site tRNA (49 and 126 structures, respectively).
<p>Data points for structures with bound A-site tRNA are colored red. The <i>high-anti</i>, <i>anti</i> and <i>syn</i> ranges are indicated.</p