Charakterisierung von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen aus <em>Sphingomonas wittichii</em> RW1 und Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens für die Quantifizierung von PQQ

Die Entschlüsselung des Genoms von S. wittichii RW1 eröffnete die Möglichkeit neuartige PQQ-abhängige Dehydrogenasen zu entdecken. Es wurden alle potentiellen Chinoproteine aus S. wittichii RW1 bioinformatisch identifiziert. Dabei wurde ersichtlich, dass dieser Organismus über insgesamt 14 putative PQQ-abhängige Dehydrogenasen verfügt. Von diesen 14 Genen wurde das Gen swit_4395 in einen neuartigen Expressionsvektor kloniert. Dieser enthielt neben dem Promotor p264 aus G. oxydans 621H, das Signalpeptid pelB aus E. coli und einen Strep-Tag mit verlängerter Linkersequenz. Das rekombinante Protein Swit_4395 wurde heterolog in E. coli und homolog in S. wittichii produziert und mittels Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Es hatte eine Größe von 39,3 kDa und wurde als Aldehyd-Dehydrogenase charakterisiert. Das Substratspektrum erstreckte sich dabei über aliphatische und aromatische Aldehyde, Di-, Hydroxy- und Ketoaldehyde und Butanal stellte das Substrat mit der höchsten katalytischen Aktivität dar (Vmax = 3970 ± 200 U/mg, KM = 12,3 mM). Als prosthetische Gruppe konnte PQQ identifiziert werden, wobei je ein Mol Enzym ein Mol PQQ bindet. Die Rekonstitution der Apoenzymform von Swit_4395 mit PQQ und Ca2+ konnte zudem erfolgreich durchgeführt werden. Bei der homologen Produktion des Protein Swit_4395 in S. wittichii konnte gezeigt werden, dass es sich um ein periplasmatisches Enzym handelt, das nativ als Homooktamer und Homododekamer vorkommt, wobei beide Formen katalytisch aktiv waren. Als Effekt der homologen Produktion konnte zudem eine erhöhte Toleranz gegenüber Butanal festgestellt werden, was darauf schließen ließ, dass es sich um ein Detoxifizierungs-System handelt. Zudem wurde eine potentielle Anwendungsmöglichkeit für das Protein Swit_4395 erprobt. Dazu wurde ein enzymatisches Verfahren für die Quantifizierung von PQQ entwickelt. Bei diesem Verfahren wurde die Apoenzymform mit definierten Mengen an PQQ oder Probenmaterial, sowie CaCl2 rekonstituiert und die enzymatische Aktivität mit Phenylglyoxal als Substrat und DCPIP als artifiziellen Elektronenakzeptor gemessen. Die Aktivität des Enzyms verläuft proportional zu dem Beladungszustand mit PQQ daher kann PQQ mit diesem System quantifiziert werden. Diese Methode ist enorm schnell, sensitiv und effizient, da die Rekonstitution innerhalb von Millisekunden abläuft und das Detektionslimit mit 0,05 nM sehr niedrig liegt. Zudem lassen sich bis zu 40.000 Messungen mit einer Enzympräparation durchführen. Es war möglich PQQ sowohl in zahlreichen Lebensmitteln wie Obst, Gemüse und alkoholischen Getränken nachzuweisen, als auch in den Kulturüberständen von PQQ-produzierenden Bakterien, wie G. oxydans, Ga. diazotrophicus, H. denitrificans und P. putida.</em

GvHD-associated, inflammasome-mediated loss of function in adoptively transferred myeloid-derived suppressor cells

Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) are a naturally occurring immune regulatory population associated with inhibition of ongoing inflammatory responses. In vitro generation of MDSC from bone marrow have been shown to enhance survival in an acute model of lethal graft-versus-host disease (GvHD). However, donor MDSC infusion only partially ameliorates GvHD lethality. In order to improve the potential therapeutic benefit and ultimately survival outcomes we set out to investigate the fate of MDSC after transfer in the setting of acute GvHD (aGvHD). MDSC transferred to lethally irradiated recipients of allogeneic donor hematopoietic grafts are exposed to an intense inflammatory environment associated with aGvHD, which we now show directly undermines their suppressive capacity. Under conditioning regimen and GvHD inflammatory settings, MDSC rapidly lose suppressor function and their potential to inhibit GvHD lethality, which is associated with their induced conversion towards a mature inflammasome-activated state. We find even brief in vitro exposure to inflammasome-activating mediators negates the suppressive potential of cultured murine and human-derived MDSCs. Consistent with a role for the inflammasome, donor MDSC deficient in the adaptor ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), that assembles inflammasome complexes, conferred improved survival of mice developing GvHD compared to wild-type donor MDSC. These data suggest the use of MDSC as a therapeutic approach for preventing GvHD and other systemic inflammatory conditions will be more effective when combined with approaches limiting in vivo MDSC inflammasome activation empowering MDSCs to maintain their suppressive potential

Equilibrative nucleoside transporter 1 (ENT1) regulates postischemic blood flow during acute kidney injury in mice

A complex biologic network regulates kidney perfusion under physiologic conditions. This system is profoundly perturbed following renal ischemia, a leading cause of acute kidney injury (AKI) — a life-threatening condition that frequently complicates the care of hospitalized patients. Therapeutic approaches to prevent and treat AKI are extremely limited. Better understanding of the molecular pathways promoting postischemic reflow could provide new candidate targets for AKI therapeutics. Due to its role in adapting tissues to hypoxia, we hypothesized that extracellular adenosine has a regulatory function in the postischemic control of renal perfusion. Consistent with the notion that equilibrative nucleoside transporters (ENTs) terminate adenosine signaling, we observed that pharmacologic ENT inhibition in mice elevated renal adenosine levels and dampened AKI. Deletion of the ENTs resulted in selective protection in Ent1–/– mice. Comprehensive examination of adenosine receptor–knockout mice exposed to AKI demonstrated that renal protection by ENT inhibitors involves the A2B adenosine receptor. Indeed, crosstalk between renal Ent1 and Adora2b expressed on vascular endothelia effectively prevented a postischemic no-reflow phenomenon. These studies identify ENT1 and adenosine receptors as key to the process of reestablishing renal perfusion following ischemic AKI. If translatable from mice to humans, these data have important therapeutic implications