Generation and Repair of DNA damage caused by DNA-Alkylation in mouse and human hematopoietic cells

Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Frage, ob und gegebenenfalls wie sich Stamm- und Vorläuferzellen in ihrer Antwort auf genotoxischen Stress von weiter differenzierten Zellen der gleichen Entwicklungslinie unterscheiden. Experimentell untersucht wurde dies am Modell der murinen und der humanen Hämatopoese, weil hier Zellen unterschiedlicher Differenzierungsstufen bereits relativ gut charakterisiert sind, sich mit etablierten Methoden beispielsweise aus Knochenmark oder Nabelschnurblut isolieren lassen und ex vivo kultiviert werden können. Als DNA-reaktive Substanz wurde aus der Gruppe monoalkylierenden Verbindungen das Zytostatikum Temozolomid (TMZ) ausgewählt, dessen Stammzell-toxisches Potential und seine ausgeprägte Knochenmark- schädigende Wirkung ein erhebliches Problem in der onkologischen Klinik darstellen. Aus Untersuchungen an Zell-Linien war bekannt, dass (i) die zytotoxische Wirkung fast ausschließlich von dem Alkylierungsprodukt O6-Methylguanin (O6-meG) ausgeht, obwohl es nur einen geringen Teil (6 %) aller TMZ-induzierten DNA-Schäden darstellt. Dieses Addukt (ii) wird in den meisten Säugerzellen effizient durch die Methyltransferase MGMT aus der genomischen DNA eliminiert. Deshalb wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht welche biologischen Konsequenzen ein durch MGMT-Gentransfer erhöhte Reparaturkapazität für dieses Addukt in primären Stamm-/ Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems der Maus und in murinen hämatopoetisvchen Zell-Linien haben. Im Hinblick auf einen möglichen klinischen Einsatz zur Myeloprotektion bei einer Chemotherapie wurde dafür die Mutante MGMTP140K verwendet, die resistent gegen den pharmakologischen MGMT-Inhibitor BG ist. Eingesetzt wurden für den Gentransfer verschiedene Retrovirale Vektorkonstrukte, die ein breites Spektrum transgener MGMTP140K-Expression erlaubten. Als wichtigste Befunde ergab sich aus diesen Experimenten: Der MGMTP140K-Gentransfer führt zu einer erheblich verbesserten Reparaturkapazität für O6-meG bei hämatopoetischen Stamm-/ Vorläufer- zellen im Knochenmark TMZ-behandelter Mäuse Die drei eingesetzten Vektorkonstrukte vermittelten eine 50-, 200- bzw 1000-fache Überexpression von MGMT in primären hämatopoetischen Zellen, die in allen Fällen ausreichte, die in vivo durch TMZ induzierten O6-meG-Addukte vollständig aus der DNA zu entfernen Es besteht eine inverse Korrelation zwischen der transgenen MGMTP140K- Expression und der in vivo Chemoprotektion / Selektion hämatopoetischer Stamm-/ Vorläuferzellen im Knochenmark BG-TMZ-behandelter Mäuse. Hämatopoetische Maus 32D-Zellen zeigen bei sehr hoher transgener MGMTP140K-Expression Wachstumsstörungen, die vermutlich auf der veränderten subzellulären Lokalisation und der verstärkten DNA-Bindung des mutierten Proteins beruhen. Diese Erkenntnisse sollten bei dem geplanten gentherapeutischen Einsatz dieser Protektionsstrategie in der Klinik berücksichtigt werden, da eine Verschiebung des physiologischen Gleichgewichts durch transgene Expression von MGMTP140K die Schutzfunktion für die Zielzellen entgegenwirken kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die durch persistierende O6-meG-Addukte ausgelöste “DNA damage response“ bei primären humanen, hämatopoetischen Stamm-/ Vorläuferzellen im Vergleich zu differenzierten T-Lymphozyten untersucht. Da Gen-Veränderungen nach struktureller DNA-Modifikation in Stamm- und Vorläuferzellen ein besonderes Risiko für das Überleben vielzelliger Organismen darstellen, reagieren Stamm-/Vorläuferzellen möglicherweise anderes als differenzierten Zellen auf dieser Art von Schäden. An aus Nabelschnurblut isolierten, TMZ-behandelten CD34+- bzw. 34--Zellen wurden folgende Befunde erhoben: Auslöser der Apoptose sind in beiden Zellpopulationen nicht-reparierte O6-meG-Addukte. Der TMZ-induzierte Zelltod ist strikt an die DNA-Replikation gekoppelt. Stamm-/ Vorläuferzellen (CD34+) weisen 12-24 Stunden nach der Behandlung wesentlich höhere Apoptoseraten im Vergleich zu ausdifferenzierten T-Lymphozyten (CD34-) auf. Im Gegensatz zu differenzierten T-Lymphozyten zeigen Stamm-/ Vorläuferzellen keinen BG-TMZ-induzierten Zellzyklusarrest in der S-Phase. CD34+-Zellen exprimieren die Protein-Kinase ATR nur in geringem Maße und zeigen nach TMZ-Exposition eine vergleichsweise niedrige Phosphorylierung der „checkpoint“-Regulatoren CHK1 und RAD17. Bei Stamm-/Vorläuferzellen ist bereits sehr früh (6 Stunden) nach BG-TMZ-Exposition die Bildung von H2AX- und RAD51-Foci (als Indikatoren für DNA-Doppelstrangbrüche) im Kern nachweisbar, während bei differenzierten T-Lymphozyten solche Foci erst im zweiten Zellzyklus nach Behandlung auftreten Diese Befunde deuten darauf hin, dass hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen prinzipiell anders auf (potenziell mutagenen) genotoxischen Stress reagieren als Zellen später Differenzierungsstadien. Für den fehlenden Zellzyklus-Arrest sowie die rasche Induktion von Apoptose in der Stammzellfraktion könnten die reduzierte Aktivierung des ATR-CHK1- Checkpoints bzw. die frühe Entstehung von DNA-Doppelstrangsbrüchen durch persistierende O6-meG-Addukten verantwortlich sein. Die biologische Bedeutung dieses ungewöhnlichen Verhaltens könnte darin liegen, durch effiziente Elimination von Stammzellen mit DNA-Schädigung der Akkumulation von Mutationen in dieser wichtigen Zellpopulation konterkarieren. Ob es sich dabei um einen Hämatopoese-spezifischen Mechanismus handelt oder um eine generelle Schutzstrategie für somatische Stammzellen muss zukünftig abgeklärt werden

Designer lipid-like peptides

A crucial bottleneck in membrane protein studies, particularly G-protein coupled receptors, is the notorious difficulty of finding an optimal detergent that can solubilize them and maintain their stability and function. Here we report rapid production of 12 unique mammalian olfactory receptors using short designer lipid-like peptides as detergents. The peptides were able to solubilize and stabilize each receptor. Circular dichroism showed that the purified olfactory receptors had alpha-helical secondary structures. Microscale thermophoresis suggested that the receptors were functional and bound their odorants. Blot intensity measurements indicated that milligram quantities of each olfactory receptor could be produced with at least one peptide detergent. The peptide detergents' capability was comparable to that of the detergent Brij-35. The ability of 10 peptide detergents to functionally solubilize 12 olfactory receptors demonstrates their usefulness as a new class of detergents for olfactory receptors, and possibly other G-protein coupled receptors and membrane proteins

A Robust and Rapid Method of Producing Soluble, Stable, and Functional G-Protein Coupled Receptors

Membrane proteins, particularly G-protein coupled receptors (GPCRs), are notoriously difficult to express. Using commercial E.coli cell-free systems with the detergent Brij-35, we could rapidly produce milligram quantities of 13 unique GPCRs. Immunoaffinity purification yielded receptors at >90% purity. Secondary structure analysis using circular dichroism indicated that the purified receptors were properly folded. Microscale thermophoresis, a novel label-free and surface-free detection technique that uses thermal gradients, showed that these receptors bound their ligands. The secondary structure and ligand-binding results from cell-free produced proteins were comparable to those expressed and purified from HEK293 cells. Our study demonstrates that cell-free protein production using commercially available kits and optimal detergents is a robust technology that can be used to produce sufficient GPCRs for biochemical, structural, and functional analyses. This robust and simple method may further stimulate others to study the structure and function of membrane proteins.United States. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA-HR0011-09-C-0012)Massachusetts Institute of Technology. Undergraduate Research Opportunities Progra

Designer Lipid-Like Peptides: A Class of Detergents for Studying Functional Olfactory Receptors Using Commercial Cell-Free Systems

A crucial bottleneck in membrane protein studies, particularly G-protein coupled receptors, is the notorious difficulty of finding an optimal detergent that can solubilize them and maintain their stability and function. Here we report rapid production of 12 unique mammalian olfactory receptors using short designer lipid-like peptides as detergents. The peptides were able to solubilize and stabilize each receptor. Circular dichroism showed that the purified olfactory receptors had alpha-helical secondary structures. Microscale thermophoresis suggested that the receptors were functional and bound their odorants. Blot intensity measurements indicated that milligram quantities of each olfactory receptor could be produced with at least one peptide detergent. The peptide detergents' capability was comparable to that of the detergent Brij-35. The ability of 10 peptide detergents to functionally solubilize 12 olfactory receptors demonstrates their usefulness as a new class of detergents for olfactory receptors, and possibly other G-protein coupled receptors and membrane proteins.United States. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA-HR0011-09-C-0012)Massachusetts Institute of Technology. Undergraduate Research Opportunities Progra

Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions

Item does not contain fulltextMicroscale thermophoresis (MST) allows for quantitative analysis of protein interactions in free solution and with low sample consumption. The technique is based on thermophoresis, the directed motion of molecules in temperature gradients. Thermophoresis is highly sensitive to all types of binding-induced changes of molecular properties, be it in size, charge, hydration shell or conformation. In an all-optical approach, an infrared laser is used for local heating, and molecule mobility in the temperature gradient is analyzed via fluorescence. In standard MST one binding partner is fluorescently labeled. However, MST can also be performed label-free by exploiting intrinsic protein UV-fluorescence. Despite the high molecular weight ratio, the interaction of small molecules and peptides with proteins is readily accessible by MST. Furthermore, MST assays are highly adaptable to fit to the diverse requirements of different biomolecules, such as membrane proteins to be stabilized in solution. The type of buffer and additives can be chosen freely. Measuring is even possible in complex bioliquids like cell lysate allowing close to in vivo conditions without sample purification. Binding modes that are quantifiable via MST include dimerization, cooperativity and competition. Thus, its flexibility in assay design qualifies MST for analysis of biomolecular interactions in complex experimental settings, which we herein demonstrate by addressing typically challenging types of binding events from various fields of life science

Designer lipid-like peptides

A crucial bottleneck in membrane protein studies, particularly G-protein coupled receptors, is the notorious difficulty of finding an optimal detergent that can solubilize them and maintain their stability and function. Here we report rapid production of 12 unique mammalian olfactory receptors using short designer lipid-like peptides as detergents. The peptides were able to solubilize and stabilize each receptor. Circular dichroism showed that the purified olfactory receptors had alpha-helical secondary structures. Microscale thermophoresis suggested that the receptors were functional and bound their odorants. Blot intensity measurements indicated that milligram quantities of each olfactory receptor could be produced with at least one peptide detergent. The peptide detergents' capability was comparable to that of the detergent Brij-35. The ability of 10 peptide detergents to functionally solubilize 12 olfactory receptors demonstrates their usefulness as a new class of detergents for olfactory receptors, and possibly other G-protein coupled receptors and membrane proteins

Osirisynes G-I, New Long-Chain Highly Oxygenated Polyacetylenes from the Mayotte Marine Sponge Haliclona sp.

International audienceChemical study of the CH2Cl2−MeOH (1:1) extract from the sponge Haliclona sp. collected in Mayotte highlighted three new long-chain highly oxygenated polyacetylenes, osirisynes G-I (1-3) together with the known osirisynes A (4), B (5), and E (6). Their structures were elucidated by 1D and 2D NMR spectra and HRESIMS and MS/MS data. All compounds were evaluated on catalase and sirtuin 1 activation and on CDK7, proteasome, Fyn kinase, tyrosinase, and elastase inhibition. Five compounds (1; 3-6) inhibited proteasome kinase and two compounds (5-6) inhibited CDK7 and Fyn kinase. Osirisyne B (5) was the most active compound with IC 50 on FYNB kinase, CDK7 kinase, and proteasome inhibition of 18.44 µM, 9.13 µM, and 0.26 µM, respectively

Microorganisms Associated with the Marine Sponge Scopalina hapalia: A Reservoir of Bioactive Molecules to Slow Down the Aging Process

Aging research aims at developing interventions that delay normal aging processes and some related pathologies. Recently, many compounds and extracts from natural products have been shown to delay aging and/or extend lifespan. Marine sponges and their associated microorganisms have been found to produce a wide variety of bioactive secondary metabolites; however, those from the Southwest of the Indian Ocean are much less studied, especially regarding anti-aging activities. In this study, the microbial diversity of the marine sponge Scopalina hapalia was investigated by metagenomic analysis. Twenty-six bacterial and two archaeal phyla were recovered from the sponge, of which the Proteobacteria phylum was the most abundant. In addition, thirty isolates from S. hapalia were selected and cultivated for identification and secondary metabolites production. The selected isolates were affiliated to the genera Bacillus, Micromonospora, Rhodoccocus, Salinispora, Aspergillus, Chaetomium, Nigrospora and unidentified genera related to the family Thermoactinomycetaceae. Crude extracts from selected microbial cultures were found to be active against seven targets i.e., elastase, tyrosinase, catalase, sirtuin 1, Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7), Fyn kinase and proteasome. These results highlight the potential of microorganisms associated with a marine sponge from Mayotte to produce anti-aging compounds. Future work will focus on the isolation and the characterization of bioactive molecules