Evaluación de matrices para la inmovilización de pseudomonas spp. en biorremediación de fenol

En el presente estudio se cultivaron Pseudomonas spp. inmovilizadas en tres matrices diferentes y un medio sin matriz con el fin de observar el comportamiento en la velocidad de remoción de un agente contaminante como el fenol y comparar los resultados en cada uno de los medios. Como matrices se seleccionaron y probaron polímeros de poliuretano, alginato (Manohar et al, 2001) y una mezcla de alginato con alcohol polivinílico (Doria et al, 2002), los cuales fueron viables para retener células. Para comparar las matrices, se sembró una concentración de Pseudomonas de 10 cfu/ml en cada una de ellas y en un medio sin matriz suplementados con un medio mínimo de sales y 200 ppm de fenol. Se observó un tiempo de remoción de 23 días en el medio sin matriz, 15 días en la matriz de poliuretano y 7 días en las matrices de alginato. En todas las matrices se obtuvo mayor concentración de células que la observada en la suspensión de células libres.Pseudomonas spp. were cultivated in a free cell suspension and also immobilised in three different matrices to observe the influence of a contaminant like phenol on degradation velocity and compare each one's results. Polyurethane polymers, alginate (Manohar et al, 2001) and a mixture of alginate and polyvinyl alcohol (Doria et al, 2002) were selected and tested as matrices; all of them proved viable as matrices for cell immobilisation. Pseudomonas were cultivated in an initial 10 cfu/ml concentration in each one of the matrices for comparison purposes and in a medium without matrix; all mediums were supplemented with a minimum salt medium and 200 ppm phenol. A removal time of 23 days was observed in the medium without matrix, 15 days in the polyurethane matrix and 7 days in the alginate matrices. Improved removal times were observed in all matrices when compared to the free cell suspension

Caracterización fisiológica y genética de cepas nativas de Bacillus sphaericus

Eighteen pathogenic native strains of Bacillus sphaericus that were pathogens to mosquito larvae were isolated from different Colombia regions. The objective of this study was to evaluate at physiological and molecular level pathogenic strains and to compare them with the reference 2362 one. Cellular growth, sporulation percentage, pathogenic activity against third instar larvae of Culex quinquejasciaius, the presence of toxigenic proteins, the size of native plasmids and the genetic polymorphism among pathogenic and non pathogenic isolations was evaluated. The evaluated strains of Bs presented a latency stage ranging from 2 to 3 h and one logarithmic phase of 7 h; the sporulation in BHI was lower than 1% to 40 h of incubation, in NYSM medium was obtained ten times more production of biomass and spores, 26% of the population showed sporulation percentage higher than 90%; the isolations were classified in three groups of pathogenicity with [Formula] and [Formula]. Punctual mutations on the genes which encoding for native toxins were detected and was found a exclusive protein of 30 kDa in pathogenic native strains. The isolations of Bs presented a plasmid of 118Kb that was not related to the toxicity; pathogenic strains are a homogenous group with a similarity between 90 to 100%, whereas non-pathogenic ones are genetically heterogeneous group and conform a cluster aside. The native strains have a great potential in biological control of mosquito larvae that transmitting diseases such as dengue, malaria, encephalitis and filariasis among others.Se aislaron 18 cepas nativas de Bacillus sphaericus patógenas a larvas de mosquitos de diferentes regiones de Colombia. El objetivo de este estudio fue evaluar a nivel fisiol6gico y molecular cepas patógenas y compararlas con la de referencia 2362. Se evaluó el crecimiento celular, el porcentaje de esporulación, la patogenicidad en larvas de tercer instar de Culex ouinquejasciatus, la presencia de las proteínas toxigénicas, el tamaño de plásmidos nativos y el polimorfismo genético entre aislamientos patógenos y no patógenos. Las cepas de Bs evaluadas presentaron una etapa de latencia de 2-3 h y una fase logarítmica de 7 h; la esporulación en BHI fue menor del 1% a las 40 h de incubación; en el medio NYSM se obtuvo diez veces más producción de biomasa y de esporas; e126% de la población mostró porcentajes de esporulación superiores al 90%; los aislamientos clasificaron en tres grupos de patogenicidad con [Fórmula] y [Fórmula] Se detectaron mutaciones puntuales en los genes que codifican para las toxinas nativas, y se ha1l6 una proteína de 30 kDa exclusiva de las cepas nativas patogénicas. Los aislamientos de Bs presentaron un plásmido de 118 Kb, no relacionado con la toxicidad; las cepas patógenas son un grupo homogéneo con una similitud entre el 90-100%, mientras que las no pat6genas son genéticamente heterogéneas y conforman un cluster aparte. Las cepas nativas tienen un gran potencial en control biológico de larvas de mosquitos transmisores de enfermedades, tales como dengue, malaria, encefalitis y filariasis, entre otras

Diversidad de bacillus sphaericus en diferentes hábitat y regiones geográficas

Bacillus sphaericus han sido reconocidos en cinco gurpos de homología con base en la hibridación DNA-DNA. Fundamentalmente, las cepas patógenas se han asociado al grupo IIA y las no patógenas a los grupos I, IIB, III, IV, y V. Treinta y dos aislamientos del complejo taxón de diferentes hábitat y regiones geográficas en Colombia y España, fueron evaluados a nivel fonotípico por patrones de perfil peptidoglicano, perfiles proteicos de fracciones celulares y a nivel molecular por polimorfismos por RAPDs, RFLPs, y secuenciación del gen 16S rRNA. Dos cladosfueron determinados por secuenciación parcial de 16S DNA en su relación a su carácter patógeno y ubcación geográfica con una divergencia superior al 4%. Los aislamientos patógenos (6/9) s ubicaron en el clado I relacionado con los grupos de referencia I, IIA, y IV. Los aislamientos de España asociados a Quercus robur Linneo (6/9) mostraron una agrupación en el clado II sin relación con grupos de homologíaLos aislamiento no patógenos de Colombia asociados a Quercus Humboldtii se relacionan tanto en el clado I como en el II igualmente sin relación con grupos de homología. Los resultados obtenidos soportan la gran heterogeneidad fenotípica y genotípica del complejo taxón de Bacillus sphaericus, sin embargo tanto los grupos de homología como los 32 de estudio se agruparon en relación co su carácter no patógenos separadamente de los patógenos independiente del hábitat y región geográfica. Este es el primer reporte de asociación de Bacillus sphaericus con el género Quercus robur LinneoDoctor en Ciencias - BiologíaDoctorad

Análisis de transferencia horizontal de genes en ensayos de biorremediación con grasas recalcitrantes

El empleo de microorganismos como herramienta para la mineralización de contaminantes orgánicos es una práctica que ha tomado mucha fuerza gracias a su eficiencia y bajo costo. La transferencia horizontal vía conjugación de genes es un requerimiento básico para optimizar procesos de biorremediación, por esta razón, además de conocer la diversidad metabólica es fundamental entender las interacciones que ocurren en una comunidad bacteriana para potenciar los procesos de biorremediación en campo. En este estudio se busca evaluar el potencial de transferencia horizontal (TH), tanto in vitro como en microcosmos de suelo, de aislamientos de bacterias obtenidas de un pasivo ambiental de grasas provenientes de la explotación carbonífera del Cerrejón. Inicialmente se agruparon los aislamientos de acuerdo con sus patrones de resistencia a antibióticos: ampicilina, cloramfenicol, gentamicina, tetraciclina y kanamicina. El potencial de TH de las cepas Vlf4, Ot3, Ot6, Pgt4, Blf11 y Vlf13 fue evaluado in vitro en medio sólido Luria-Bertani (LB) donde se obtuvieron nuevos fenotipos a partir de los cruces Vlf13xOt6 y Pgt4xOt6, el nuevo fenotipo indica resistencia a los dos marcadores (ampR, kanR) y su morfología sugiere que el receptor, en los dos casos, es la cepa Ot6. Los parentales Vlf13, Pgt4 y Ot6 fueron identificados por amplificación del gen RNAr 16S como Pseudomonas sp., Pseudomonas sp. y Chryseobacterium sp., respectivamente, y los transconjugantes como Chryseobacterium sp. Posteriormente, estos dos cruces fueron sometidos a ensayos de transferencia horizontal en microcosmos de suelos, donde se hizo evidente nuevamente la presencia de TH a una menor tasa. Los resultados obtenidos indican la posibilidad de un potencial de transferencia horizontal de genes entre los aislamientos seleccionados, dando lugar a la probabilidad de formular en futuros estudios un consorcio de bacterias que demuestran tener esta ventaja adaptativa.The use of microorganisms as a tool for the mineralization of organic pollutants is a practice that has begun to gain strength due to its efficiency and low cost. Horizontal gene transfer by conjugation is important for the optimization of bioremediation processes. For this reason it is fundamental to study the metabolic diversity of catabolic pathways, but we must also understand the microbial interactions occurring in bioremediation consortia. This will help us improve bioremediation in field. The purpose of this study was to evaluate the horizontal gene transfer (HGT) potential, in vitro and in soil microcosms, of bacterial strains isolated from grease samples obtained from a disposal site situated in the coal mine “Cerrejon”. Initially the isolates were grouped by selective markers: Ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, tetracycline and kanamycin. The HGT potential of strains: Vlf4, Ot3, Ot6, Pgt4, Blf11 y Vlf13 was evaluated in vitro on Luria-Bertani LB agar. New phenotypes were obtained from matings between Vlf13xOt6 and Pgt4xOt6. The new phenotype indicates resistances to both antibiotic markers and its morphology suggests that isolate Ogt6 is the receptor in both cases. The parental strains Vlf13, Pgt4 and Ot6 were identified by RNAr 16S as Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. and Chryseobacterium sp. respectively and the transconjugants as Chryseobacterium sp. Subsequently soil microcosms were conducted with Vlf13xOt6 and Pgt4xOt6 and new phenotypes were detected at a lower rate again but with the same possible receptor but. These results suggest the possibility of horizontal gene transfer potential within the selected isolates, giving the possibility of formulating, in future studies, a bacterial consortium with an adaptive advantage

Minimal NOx emission by Lysinibacillus sphaericus in nutrient poor soil

The aim of this study was to determine whether nitrogen dioxide emissions by Lysinibacillus sphaericus exist in nutrient poor soil. First, we evaluated the presence of two genes involved in denitrification (nosF and nosD) by PCR screening of five strains of L. sphaericus (III (3)7, OT4b.49, OT4b.25, OT4b.31 and CBAM5). We then applied a bacterial consortium made up by L. sphaericus III (3)7 and OT4b.49 into closed microcosms of soil and with minimum salts medium (MSM) supplemented with ammonia to measure the concentration of produced nitrogen dioxide over time. The assays with closed microcosms showed a minimum level of nitrogen dioxide over time. The nosF and nosD primers amplified the expected fragment for the five strains and the sequenced nosF and nosD PCR product showed an ATPase domain and a copper-binding domain respectively, which was consistent with the function of these genes. The basal emission of nitrogen dioxide by L. sphaericus in soil is coupled to its ability to enhance the nitrogen bioavailability for soils deficient in nutrients. Therefore, our results indicate that this microorganism can be considered as a good candidate to validate the low emission of NOx in field and in the future as an alternative for biofertilization

Análisis de transferencia horizontal de genes en ensayos de biorremediación con grasas recalcitrantes

El empleo de microorganismos como herramienta para la mineralización de contaminantes orgánicos es una práctica que ha tomado mucha fuerza gracias a su eficiencia y bajo costo. La transferencia horizontal vía conjugación de genes es un requerimiento básico para optimizar procesos de biorremediación, por esta razón, además de conocer la diversidad metabólica es fundamental entender las interacciones que ocurren en una comunidad bacteriana para potenciar los procesos de biorremediación en campo. En este estudio se busca evaluar el potencial de transferencia horizontal (TH), tanto in vitro como en microcosmos de suelo, de aislamientos de bacterias obtenidas de un pasivo ambiental de grasas provenientes de la explotación carbonífera del Cerrejón. Inicialmente se agruparon los aislamientos de acuerdo con sus patrones de resistencia a antibióticos: ampicilina, cloramfenicol, gentamicina, tetraciclina y kanamicina. El potencial de TH de las cepas Vlf4, Ot3, Ot6, Pgt4, Blf11 y Vlf13 fue evaluado in vitro en medio sólido Luria-Bertani (LB) donde se obtuvieron nuevos fenotipos a partir de los cruces Vlf13xOt6 y Pgt4xOt6, el nuevo fenotipo indica resistencia a los dos marcadores (ampR, kanR) y su morfología sugiere que el receptor, en los dos casos, es la cepa Ot6. Los parentales Vlf13, Pgt4 y Ot6 fueron identificados por amplificación del gen RNAr 16S como Pseudomonas sp., Pseudomonas sp. y Chryseobacterium sp., respectivamente, y los transconjugantes como Chryseobacterium sp. Posteriormente, estos dos cruces fueron sometidos a ensayos de transferencia horizontal en microcosmos de suelos, donde se hizo evidente nuevamente la presencia de TH a una menor tasa. Los resultados obtenidos indican la posibilidad de un potencial de transferencia horizontal de genes entre los aislamientos seleccionados, dando lugar a la probabilidad de formular en futuros estudios un consorcio de bacterias que demuestran tener esta ventaja adaptativa. Palabras clave: conjugación, trasnconjugantes, replica plating. Abstract: The use of microorganisms as a tool for the mineralization of organic pollutants is a practice that has begun to gain strength due to its efficiency and low cost. Horizontal gene transfer by conjugation is important for the optimization of bioremediation processes. For this reason it is fundamental to study the metabolic diversity of catabolic pathways, but we must also understand the microbial interactions occurring in bioremediation consortia. This will help us improve bioremediation in field. The purpose of this study was to evaluate the horizontal gene transfer (HGT) potential, in vitro and in soil microcosms, of bacterial strains isolated from grease samples obtained from a disposal site situated in the coal mine “Cerrejon”. Initially the isolates were grouped by selective markers: Ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, tetracycline and kanamycin. The HGT potential of strains: Vlf4, Ot3, Ot6, Pgt4, Blf11 y Vlf13 was evaluated in vitro on Luria-Bertani LB agar. New phenotypes were obtained from matings between Vlf13xOt6 and Pgt4xOt6. The new phenotype indicates resistances to both antibiotic markers and its morphology suggests that isolate Ogt6 is the receptor in both cases. The parental strains Vlf13, Pgt4 and Ot6 were identified by RNAr 16S as Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. and Chryseobacterium sp. respectively and the transconjugants as Chryseobacterium sp. Subsequently soil microcosms were conducted with Vlf13xOt6 and Pgt4xOt6 and new phenotypes were detected at a lower rate again but with the same possible receptor but. These results suggest the possibility of horizontal gene transfer potential within the selected isolates, giving the possibility of formulating, in future studies, a bacterial consortium with an adaptive advantage. Key words: Conjugation, transconjugants, replica plating

A Novel Bacterial-Mediated Method for the Differentiation of Aedes spp. Larvae in Mixed-Nursery Assays and Its Application in the Determination of Vegetative Lysinibacillus sphaericus Biocontrol Efficiency in Invasive Vector Eradication

The establishment of Aedes aegypti and the recent invasion of Aedes albopictus has put Colombia at risk, as it now harbours two arboviral vector species. Studies have shown the susceptibility of Aedes aegypti to the vegetative toxins produced by Lysinibacillus sphaericus. This study aims to determine the potential of two L. sphaericus strains in the control of both Aedes species present in Colombia, in both single and mixed species nurseries. Given the similarities between both species, there exists a need to differentiate them for the development of precise control strategies. Accordingly, mixed nurseries employed a red fluorescent protein (mRFP)-expressing Escherichia coli strain as a differentiator. Coloration-aided differentiation facilitated the analysis of mixed nursery treatments and provided deeper scrutiny into the variables at play. This showed an increase in the biocontrol efficiency, pointing to probable ecological variables. Bioassays involving Ae. albopictus showed a lower resistance to the one reported for Ae. aegypti in single-species nurseries. The study concludes that the use of E. coli strains expressing fluorescent proteins are useful tools to be employed in areas like public health entomology. Moreover, it was found that the use of L. sphaericus strains for biocontrol of vector mosquitoes is a viable alternative to chemical insecticides

Synergistic Activity Between S-Layer Protein and Spore–Crystal Preparations from Lysinibacillus sphaericus Against Culex quinquefasciatus Larvae

Lysinibacillus sphaericus is used for the biological control of mosquitoes. The main toxicity mechanism of pathogenic strains is a binary toxin produced during sporulation. S-layer is a proteinaceous structure on the surface of bacteria; its functions have been involved in the interaction between bacterial cells and the environment, for example, as protective coats, surface recognition, and biological control. In L. sphaericus, S-layer protein (SlpC) is expressed in vegetative cells, and is also found in spore–crystal preparations; it has larvicidal activity in Culex spp. In this study, partial and completed sporulated culture toxicities were compared; also, S-layer protein and spore–crystal proteins were tested against Culex quinquefasciatus larvae for possible interactions. Larvicidal activity obtained with a combination of SlpC and spore–crystal proteins from strain III(3)7 showed no significant interaction, whereas, combinations of both preparations from strain 2362 showed synergistic effect. The highest synergistic activity observed was between spore protein complex from strain 2362 and SlpC from III(3)7. S-layer protein could be considered a good alternative in formulation improvement, for biological control of mosquitoes

Evaluación de matrices para la inmovilización de Pseudomonas spp. en biorremediación de fenol

En el presente estudio se cultivaron Pseudomonas spp. inmovilizadas en tres matrices diferentes y un medio sin matriz con el fin de observar el comportamiento en la velocidad de remoción de un agente contaminante como el fenol y comparar los resultados en cada uno de los medios. Como matrices se seleccionaron y probaron polímeros de poliuretano, alginato (Manohar et al, 2001) y una mezcla de alginato con alcohol polivinílico (Doria et al, 2002), los cuales fueron viables para retener células. Para comparar las matrices, se sembró una concentración de Pseudomonas de 10 cfu/ml en cada una de ellas y en un medio sin matriz suplementados con un medio mínimo de sales y 200 ppm de fenol. Se observó un tiempo de remoción de 23 días en el medio sin matriz, 15 días en la matriz de poliuretano y 7 días en las matrices de alginato. En todas las matrices se obtuvo mayor concentración de células que la observada en la suspensión de células libres