Cloning, expression in Pichia pastoris, and characterization of a thermostable GH5 mannan endo-1,4-β-mannosidase from Aspergillus niger BK01

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Mannans are key components of lignocellulose present in the hemicellulosic fraction of plant primary cell walls. Mannan endo-1,4-β-mannosidases (1,4-β-<smcaps>D</smcaps>-mannanases) catalyze the random hydrolysis of β-1,4-mannosidic linkages in the main chain of β-mannans. Biodegradation of β-mannans by the action of thermostable mannan endo-1,4-β-mannosidase offers significant technical advantages in biotechnological industrial applications, <it>i.e</it>. delignification of kraft pulps or the pretreatment of lignocellulosic biomass rich in mannan for the production of second generation biofuels, as well as for applications in oil and gas well stimulation, extraction of vegetable oils and coffee beans, and the production of value-added products such as prebiotic manno-oligosaccharides (MOS).</p> <p>Results</p> <p>A gene encoding mannan endo-1,4-β-mannosidase or 1,4-β-<smcaps>D</smcaps>-mannan mannanohydrolase (E.C. 3.2.1.78), commonly termed β-mannanase, from <it>Aspergillus niger </it>BK01, which belongs to glycosyl hydrolase family 5 (GH5), was cloned and successfully expressed heterologously (up to 243 μg of active recombinant protein per mL) in <it>Pichia pastoris</it>. The enzyme was secreted by <it>P. pastoris </it>and could be collected from the culture supernatant. The purified enzyme appeared glycosylated as a single band on SDS-PAGE with a molecular mass of approximately 53 kDa. The recombinant β-mannanase is highly thermostable with a half-life time of approximately 56 h at 70°C and pH 4.0. The optimal temperature (10-min assay) and pH value for activity are 80°C and pH 4.5, respectively. The enzyme is not only active towards structurally different mannans but also exhibits low activity towards birchwood xylan. Apparent K_mvalues of the enzyme for konjac glucomannan (low viscosity), locust bean gum galactomannan, carob galactomannan (low viscosity), and 1,4-β-<smcaps>D</smcaps>-mannan (from carob) are 0.6 mg mL^-1, 2.0 mg mL^-1, 2.2 mg mL^-1and 1.5 mg mL^-1, respectively, while the k_catvalues for these substrates are 215 s^-1, 330 s^-1, 292 s^-1and 148 s^-1, respectively. Judged from the specificity constants k_cat/K_m, glucomannan is the preferred substrate of the <it>A. niger</it> β -mannanase. Analysis by thin layer chromatography showed that the main product from enzymatic hydrolysis of locust bean gum is mannobiose, with only low amounts of mannotriose and higher manno-oligosaccharides formed.</p> <p>Conclusion</p> <p>This study is the first report on the cloning and expression of a thermostable mannan endo-1,4-β-mannosidase from <it>A. niger </it>in <it>Pichia pastoris</it>. The efficient expression and ease of purification will significantly decrease the production costs of this enzyme. Taking advantage of its acidic pH optimum and high thermostability, this recombinant β-mannanase will be valuable in various biotechnological applications.</p

Comparative secretome analyses of two Trichoderma reesei RUT-C30 and CL847 hypersecretory strains

ABSTRACT: BACKGROUND: Due to its capacity to produce large amounts of cellulases, Trichoderma reesei is increasingly been researched in various fields of white biotechnology, especially in biofuel production from lignocellulosic biomass. The commercial enzyme mixtures produced at industrial scales are not well characterized, and their proteinaceous components are poorly identified and quantified. The development of proteomic methods has made it possible to comprehensively overview the enzymes involved in lignocellulosic biomass degradation which are secreted under various environmental conditions. RESULTS: The protein composition of the secretome produced by industrial T. reesei (strain CL847) grown on a medium promoting the production of both cellulases and hemicellulases was explored using two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF or LC-MS/MS protein identification. A total of 22 protein species were identified. As expected, most of them are potentially involved in biomass degradation. The 2D map obtained was then used to compare the secretomes produced by CL847 and another efficient cellulolytic T. reesei strain, Rut-C30, the reference cellulase-overproducing strain using lactose as carbon source and inducer of cellulases. CONCLUSION: This study provides the most complete mapping of the proteins secreted by T. reesei to date. We report on the first use of proteomics to compare secretome composition between two cellulase-overproducing strains Rut-C30 and CL847 grown under similar conditions. Comparison of protein patterns in both strains highlighted many unexpected differences between cellulase cocktails. The results demonstrate that 2D electrophoresis is a promising tool for studying cellulase production profiles, whether for industrial characterization of an entire secretome or for a more fundamental study on cellulase expression at genome-wide scale

Human genetic polymorphisms in T1R1 and T1R3 taste receptor subunits affect their function.

International audienceUmami is the typical taste induced by monosodium glutamate (MSG), which is thought to be detected by the heterodimeric G protein-coupled receptor, T1R1 and T1R3. Previously, we showed that MSG detection thresholds differ substantially between individuals and we further showed that nontaster and hypotaster subjects are associated with nonsynonymous single polymorphisms occurring in the T1R1 and T1R3 genes. Here, we show using functional expression that both amino acid substitutions (A110V and R507Q) in the N-terminal ligand-binding domain of T1R1 and the 2 other ones (F749S and R757C), located in the transmembrane domain of T1R3, severely impair in vitro T1R1/T1R3 response to MSG. A molecular model of the ligand-binding region of T1R1/T1R3 provides a mechanistic explanation supporting functional expression data. The data presented here support causal relations between the genotype and previous in vivo psychophysical studies in human evaluating sensitivity to MSG

Développement de nouveaux outils fongiques respectueux de l'environnement (écoprocédés) pour la production de pâtes chimiques blanchies de résineux

Les biotechnologies peuvent être utilisées dans le domaine de l'industrie papetière comme alternatives aux procédés chimiques de production de pâtes à papier. Dans le cadre de ces travaux de thèse nous avons souhaité exploiter les avancées technologiques dans le domaine de la génomique et de l'ingénierie des protéines pour améliorer les procédés biotechnologiques appliqués à la production et au blanchiment de pâtes chimiques. Dans une première partie, le secrétome du Basidiomycète Phanerochaete chrysosporium, cultivé sur copeaux de bois de résineux en conditions de biopulping, a été analysé. Une approche protéomique a été choisie, en exploitant le génome de ce champignon. L'analyse protéomique a révélé la production de différentes enzymes impliquées dans la biodégradation des constituants du bois. La sécrétion de certaines des enzymes identifiées a été démontrée pour la première fois. Les copeaux de bois traités ont par la suite été soumis à un procédé de mise en pâte chimique (procédé kraft) et à un blanchiment au dioxyde de chlore. Le traitement fongique a conduit à une augmentation du rendement en pâte kraft, accompagnée d'une augmentation de la blancheur finale de la pâte produite et d'une diminution de la consommation en réactifs de blanchiment. Ces effets peuvent être partiellement expliqués par une production d'enzymes spécifique de dégradation du bois. Dans la deuxième partie de ces travaux, la laccase du Basidiomycète Pycnoporus cinnabarinus a été modifiée par fusion à un module de fixation aux carbohydrates (CBM) fongique. La laccase-CBM obtenue a pu être produite chez Aspergillus niger, et ses capacités de fixation à un substrat cellulosique et à des fibres de pâte kraft de résineux ont été évaluées. La laccase-CBM a été comparée à la laccase de P. cinnabarinus dans des essais de délignification et de blanchiment d'une pâte kraft de résineux, en présence d'un médiateur d'oxydoréduction (hydroxybenzotriazole). La présence du CBM a permis d'améliorer la biodélignification de la pâte kraft étudiée par la laccase, conduisant à une diminution de la charge enzymatique, une augmentation de la blancheur finale de la pâte, une diminution de la consommation en dioxyde de chlore et une préservation des propriétés mécaniques des fibres. Des analyses microscopiques ont révélé une pénétration de la laccase-CBM dans la paroi des fibres, et sa rétention au sein des fibres à la fin du traitement enzymatique.Biotechnologies can be applied to paper industry as an alternative to chemical processes for pulp and paper production. In this work advances in genomic and protein engineering were used to improve biotechnological processes applied to chemical pulps production and bleaching. In the first part of this work, the Phanerochaete chrysosporium secretome, grown on softwood chips under biopulping conditions was analysed. A proteomic approach was chosen, using the P. chrysosporium genome. Proteomic analysis revealed the production of several enzymes involved in wood biodegradation. The secretion of some of the identified enzymes was demonstrated for the first time. Biotreated wood chips were further submitted to kraft cooking and chlorine dioxide bleaching. Fungal treatment led to an increase of pulp yield, as well as an increase of pulp final brightness and a decrease in chlorine dioxide consumption. These effects could be partially explained by the production of specific wood-degrading enzymes. In the second part, Pycnoporus cinnabarinus laccase was fused to a fungal carbohydrate binding module (CBM). The laccase-CBM was produced in Aspergillus niger, and binding capabilities of the enzyme on a cellulosic substrate and on softwood kraft pulp fibers were evaluated. Laccase-CBM and P. cinnabarinus laccase were compared for their softwood kraft pulp biobleaching potential, in the presence of a redox mediator (hydroxybenzotriazole). The presence of the CBM could improve pulp biodelignification with laccase, leading to a decrease in the enzymatic charge, an increase of pulp final brightness, a decrease in chlorine dioxide consumption and a preservation of pulp mechanical properties. Microscopic examinations revealed a penetration of the laccase-CBM in the fiber wall, and retention of the enzyme inside the pulp fibers at the end of the enzymatic treatment.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Des champignons pour réhabiliter les sols pollués

Des champignons pour réhabiliter les sols pollué

Exploration du genre Pycnoporus pour la production d'une nouvelle tyrosinase (de l'expression du gène aux applications biotechnologiques)

Ce travail a eu pour objectif l'exploration des potentialités du genre Pycnoporus à synthétiser une nouvelle tyrosinase d'intérêt biotechnologique dans le domaine agro-alimentaire. Une nouvelle tyrosinase a été isolée, purifiée et caractérisée à partir de la souche P. sanguineus BRFM49. Cette enzyme s'est révélée d'un grand intérêt pour la synthèse de molécules à haute valeur ajoutée comme des anti-oxydants ou des polymères de nouvelle génération. Deux voies complémentaires ont été explorées afin d'améliorer le niveau de production de la tyrosinase. La première, qui a consisté à sélectionner, par génétique classique, des lignées monocaryotiques génétiquement stables, n'a pas permis d'améliorer, de façon significative, l'activité tyrosinase chez P. sanguineus BRFM49. La seconde a consisté à réaliser la production de la tyrosinase dans un système d'expression hétérologue. Pour cela, le gène de la tyrosinase (2204 pb) et l'ADNc correspondant (1857 pb) ont été clonés et caractérisés. La production hétérologue de la tyrosinase de P. sanguineus a été réalisée chez un champignon hyper-producteur de protéines, Aspergillus niger. Pour cela, l'ADNc correspondant a été fusionné à la séquence d'adressage de la glucoamylase d'A. niger et placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort. Cette construction a permis de sécréter la protéine active dans le milieu extracellulaire. La souche A. niger D15#26-e, présentant le meilleur niveau de production (50 mg/L), a été sélectionnée pour purifier et caractériser la tyrosinase recombinante et comparer celle-ci à l'enzyme native. Cette étude a montré que l'enzyme recombinante est aussi efficace que la tyrosinase native pour la réticulation de protéines modèlesAIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Etudes préliminaires pour la mise en œuvre d’un traitement biologique de sols pollués par des HAPs impliquant des champignons filamenteux

Etudes préliminaires pour la mise en œuvre d’un traitement biologique de sols pollués par des HAPs impliquant des champignons filamenteux. Salon Pollutec 9

Maîtrise de la production et de la mise en oeuvre d'enzymes ligninolytiques fongiques dans le domaine papetier

L'ELIMINATION DE LA LIGNINE DES COMPOSES LIGNOCELLULOSIQUES RESTE LE PROBLEME MAJEUR DE L'INDUSTRIE PAPETIERE. COUTEUSE EN ENERGIE ET FORTEMENT POLLUANTE, ELLE GENERE DES CHLOROLIGNINES FORTEMENT TOXIQUES POUR L'HOMME. CES CONSIDERATIONS ECONOMIQUES ET ECOLOGIQUES ONT INCITE LA PROFESSION A RECHERCHER DES INNOVATIONS TECHNOLOGIQUES. DANS CE CONTEXTE, LES PROCEDES BIOTECHNOLOGIQUES BASES SUR DES ENZYMES FONGIQUES LIGNINOLYTIQUES REPRESENTENT UNE ALTERNATIVE PARTICULIEREMENT SEDUISANTE. LES TRAVAUX REALISES DANS LE CADRE DE CETTE THESE CONCERNENT LA MAITRISE DE LA PRODUCTION ET DE LA MISE EN UVRE DANS LE DOMAINE PAPETIER DE DEUX TYPES D'ENZYMES LIGNINOLYTIQUES, LA LACCASE ET LA MANGANESE PEROXYDASE (MNP). DANS UN PREMIER TEMPS, NOUS AVONS SELECTIONNE PAR DES METHODES DE LA GENETIQUE FORMELLE DES SOUCHES MONOCARYOTIQUES DE PYCNOPORUS CINNABARINUS HYPERPRODUCTRICES DE LACCASES. DEUX SOUCHES ONT AINSI ETE SELECTIONNEES. PAR LA SUITE, DEUX ISOFORMES DE LA LACCASE ONT ETE ISOLEES ET CARACTERISEES CHEZ LA MEILLEURE DES SOUCHES SELECTIONNEE (P. CINNABARINUS SS3). NOS TRAVAUX SE SONT ENSUITE ORIENTES VERS LA MAITRISE DE LA PRODUCTION A L'ECHELLE PILOTE DE MNP PAR UNE SOUCHE HYPERPRODUCTRICE (PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM I-1512). L'EXTRAPOLATION D'UNE TECHNIQUE DE CULTURE MISE AU POINT PAR NOTRE UNITE, ASSOCIANT UN SYSTEME IMMOBILISE AVEC UN REACTEUR DE TYPE AIR-LIFT A PERMIS D'OBTENIR DES TAUX DE PRODUCTION DE MNP SANS PRECEDENTS. ENFIN, DE NOUVEAUX PROCEDES METTANT EN UVRE IN VITRO LA LACCASE ET LA MNP SUR DEUX TYPES DE PATES INDUSTRIELLES (PEUPLIER ET PAILLE DE BLE) ONT ETE DEVELOPPES. LES POTENTIALITES DE CES ENZYMES ONT ETE CLAIREMENT DEMONTREES PERMETTANT : - DES GAINS D'ENERGIE LORS DE L'ETAPE DE RAFFINAGE, ENTRAINANT UNE REDUCTION DU COUT DE PRODUCTION ; - UNE DELIGNIFICATION SELECTIVE IMPORTANTE PERMETTANT UNE REDUCTION SIGNIFICATIVE DU REJET DE CHLOROLIGNINES DANS LES EFFLUENTS PAPETIERS.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Etude de la réduction de la consommation énergétique du raffinage des pâtes chimique par traitement enzymatique

Le raffinage des pâtes chimiques blanchies est de première importance pour produire des papiers suffisamment résistants répondant aux exigences de production sur machine et de qualité. Cette étape permet de modifier les caractéristiques morphologiques des fibres, d'améliorer la formation de la feu ille et d'augmenter les résistances mécaniques du papier. Le raffinage requiert jusqu'à 30% de la consommation totale d'une usine de production de papiers; en conséquence, des solutions visant à réduire la facture énergétique de ce poste sont recherchées. Dans ce contexte, l'utilisation d'enzymes dans le processus de préparation des fibres est une de ces solutions respectueuse de l'environnement. Des enzymes présentant des actions ciblées sur les composants de la paroi des fibres ont été appliquées à des pâtes commerciales blanchies issues de la cuisson de mélanges de résineux et de la cuisson d'eucalyptus brésilien avant raffinage. Grâce à ces travaux, l'impact du traitement enzymatique sur l'organisation des composés de la paroi et les propriétés des fibres a été évalué et quantifié. Les résultats diffèrent d'une enzyme à l'autre. Les enzymes ayant une activité cellobiohydrolase, xylanase ou mannanase ont présenté une action limitée. Peu de changements été observés. Seul le traitement par une xylanase a permis une amélioration de blancheur. Les cellu1ases présentant une activité endoglucanase majoritaire ont conduit à une ouverture de la structure des fibres, une augmentation de la proportion d'eau liée et de la résistance à la rupture du papier. L'observation en microscopie électronique couplé à de l'immunomarquage a par ailleurs permis de mettre en évidence la pénétration de cette enzyme au coeur de la paroi de la fibre. Toutefois, dans le cas de la pâte de résineux, la longueur des fibres a fortement été réduite. L'optimisation des conditions de traitement mécanique au travers d'une diminution de l'intensité de raffinage et de la quantité d'enzymes appliquée a permis de limiter la perte de résistance au déchirement consécutive à cette coupe. Dans ces conditions, en acceptant une diminution des résistances de 10% pour la rupture et de 13% pour le déchirement, une économie d'énergie de raffinage de 40% devient possible. Dans le cas de la pâte d'eucalyptus, les endoglucanases ont généré les effets les plus importants avec une augmentation de la résistance des feuilles et une égouttabilité supérieure. Avec un raffinage enzymatique optimisé, il devient possible de réduire de 45% la consommation d'énergie pour atteindre une résistance à la rupture de la feuille de papier de 4km (longueur de rupture)To produce papers matching with the requirements of paper machines and customers , it is of of the utmost importance to refine bleached chemical pulps. This stage allows modifying the morphological characteristics of fibres, to improve the paper formation and to develop the mechanical resistance of paper. The refining requires up to 30 % of the total energy consumption of a paper mill. Consequently, it is a key issue to look for solutions aiming at reducing the energy bill of this post. In this context, the addition of enzymes in the process could be one of these environmentally friendly solutions. The enzymes chosen, introduced before refining, have a specific action on the fibre wall chemid ll components of bleached kraft pulps which have been obtained from a mix of softwood or fram Brazilian eucalyptus. Results of introducing the enzyme allowed assessment and quantification of the impact of the enzyme treatment on fibre compounds organization and praperties. The consequences of the enzyme treatment differed from an enzyme to another one. Enzymes presenting an activity cellobiohydrolase, xylanase or mannanase had limited effects. Changes were too narrow to be noticed. Xylanase treatment only resulted in an improvement in pulp brightness. Cellulases presenting major endoglucanase activity opened the structure of fibres, increasing the proportion of linked water in the wall and the tensile strength of paper. Observations with electron microscopy coupled with immunolabelling technique showed the penetration of this enzyme through the fibre wall. Nevertheless, in the case of softwood pulp, fibre length dropped. The optimization of the enzyme amount and the mechanical treatment through a reduction of the refining intensity, reduced tear strength losses. In these conditions, if a reduction of 10 % of tensile strength and 13 % of tear strength can be tolerated, 40 % of refining energy could be saved. ln the case of eucalyptus pulp, endoglucanases generated the most important effects with an improvement of the paper resistance and a better drainage. With an optimizedenzymatic refining, it became possible to reduce the energy consumption by 45 % to reach 4km of breaking length, while maintaining high levels in the other relevant parameters.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF