The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.

Nucleoplasmin is a histone chaperone that consists of a pentameric N-terminal domain and an unstructured C-terminal tail. The pentameric core domain, a doughnut-like structure with a central pore, is only found in the nucleoplasmin family. Here, we report the first structure of a nucleoplasmin-like domain (NPL) from the unrelated Drosophila protein, FKBP39, and we present evidence that this protein associates with chromatin. Furthermore, we show that two other chromatin proteins, Arabidopsis thaliana histone deacetylase type 2 (HD2) and Saccharomyces cerevisiae Fpr4, share the NPL fold and form pentamers, or a dimer of pentamers in the case of HD2. Thus, we propose a new family of proteins that share the pentameric nucleoplasmin-like NPL domain and are found in protists, fungi, plants and animals.We are grateful to Gunter Stier for providing the vector; Michael Nilges, Oleg Fedorov, Benjamin Bardiaux, Stefanie Hartmann and Wolfgang Rieping for helpful discussions; and Daniel Nietlispach for NMR expertise. We thank Renato Paro for generously providing us with an anti-FKBP39 antibody. We would like to thank the Wellcome Trust for financial support (grant 082010/Z/07/Z). V.T.F. and E.D.L. acknowledge support from Engineering and Physical Sciences Research Council under grants GR/R99393/01 and EP/C015452/1 for the creation of the Deuteration Laboratory platform operating within the Grenoble Partnership for Structural Biology. V.T.F. also acknowledges support from the European Union under contract RII3-CT-2003-505925. J.B.A. acknowledges the provision of a postdoctoral fellowship held at Keele University. M.R.P. and D.M.G. were supported by the Medical Research Council and Cancer Research UK grants to D.M.G. A.A.W. is a recipient of a Wellcome Trust Fellowship092441/Z/10/Z. J.D. and M.D. were supported by the Harmonia 5 Grant 2013/10/M/NZ2/00298 from the Polish National Science Center. The authors would like to thank the Institut Laue-Langevin (ILL), the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) and the European Molecular Biology Laboratory Hamburg outstation (EMBL-HH) for the provision of beamtime and access to the experimental facilities of D22, ID14eh3 and X33 respectively. We would also like to thank the local contacts at all the facilities for providing assistance in using the beam lines.This is the final version of the article. It first appeared from Elsevier via http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2015.03.01

The Pentameric Nucleoplasmin Fold Is Present in Drosophila FKBP39 and a Large Number of Chromatin-Related Proteins

Nucleoplasmin is a histone chaperone that consists of a pentameric N-terminal domain and an unstructured C-terminal tail. The pentameric core domain, a doughnut-like structure with a central pore, is only found in the nucleoplasmin family. Here, we report the first structure of a nucleoplasmin-like domain (NPL) from the unrelated Drosophila protein, FKBP39, and we present evidence that this protein associates with chromatin. Furthermore, we show that two other chromatin proteins, Arabidopsis thaliana histone deacetylase type 2 (HD2) and Saccharomyces cerevisiae Fpr4, share the NPL fold and form pentamers, or a dimer of pentamers in the case of HD2. Thus, we propose a new family of proteins that share the pentameric nucleoplasmin-like NPL domain and are found in protists, fungi, plants and animals

Caractérisations biochimiques et structurales de la γE cristalline de rat, hydrogénée et perdeutériée en vue d'une étude de diffraction des neutrons.

All vertebrate eye lenses are transparent and have a refractive power depending on a smooth refractive index gradient for visible light. This is achieved by the regular arrangement of the fibre cell and by the differential expression of lens specific proteins, the crystallins. The increasing refractive index from the cortex to the nuclear region is associated with increasing concentration of crystallins relative to water. The nuclear region, where the refractive index is the highest, is enriched with γ crystallins, a family of monomeric polypeptides synthesised mainly during the early development, that play a major role in forming the closely packed medium. However, the high concentration is near a critical point whereby very soluble proteins undergo a low energy phase separation driven by the competing forces of protein-water, water-water and protein-protein interactions. This phase separation is crucial in the opacification of lens fibre cells found in certain forms of mammalian cataract. A high resolution neutron diffraction study can supplement the existing X-ray data and allows us to make detailed and thorough analysis of the solvent organisation around the crystalline molecule. This will provide a structural base for studying the effect on protein-water, water-water and protein-protein interactions. This study will be greatly facilitated by the use of fully deuterated protein. Substituting deuterium for hydrogen will reduce the incoherent scattering background, strengthen the high resolution diffraction data and provide an order of magnitude gain in signal to noise. The exchange of the hydrogen by deuterium can be achieved by soaking protein crystals in deuterated liquor but these exchangeable hydrogens represent only 25% of total hydrogens of the protein. The exchange of all hydrogen atoms can only be achieved by an in vivo biosynthesis using a bacterial culture in a deuterated medium (deuterated glycerol and D2O). γE crystalline from rat has been chosen as a model protein system to locate hydrogen atoms of water molecules surrounding the protein and hydrogens involved in different stabilising interactions. Large quantities of the hydrogenated and perdeuterated protein were expressed in Escherichia coli grown in minimal medium and then purified. The level of the isotope substitution on non-exchangeable sites of the protein was found to be 98% by electrospray ionisation mass spectrometry. In the absence of known biochemical activity, the hydrogenated and deuterated γE crystallins were characterised by non denaturing gel electrophoresis, isoelectric point determination and limited proteolysis. There are no major biochemical differences between these two forms of protein. Further characterisations by Fourier transform infrared (FTIR) and circular dichroism (CD) spectroscopies did not show any significant differences. The hydrogenated and deuterated proteins were crystallised in H2O and D2O buffers. Crystallisation conditions, space groups and cell parameters were found to be the same for all forms of the protein. Comparison of these four forms of γE crystallin revealed no significant structural difference between them at the atomic resolution around 1.4Å. However, the temperature factor variation of the structures at identical resolution (HγEh2o HγEd2o and DγEh2o) depends on the isotope labelling. The structures of the deuterated protein in H2O or the hydrogenated one with D2O solvent have a lower temperature factor. The molecular model of γE crystalline has been obtained at 1.36Å and some new relevant details on the structure and water network surrounding the protein are described in this report. Neutron diffraction data collection cannot be carried out before crystal size improvement, but most importantly, we have shown that perdeuteration itself does not alter the structural features of the protein.Tous les cristallins des vertébrés sont transparents et ont un pouvoir de réfraction. Ceci est dû à l'arrangement régulier de cellules et à l'expression différentielle de protéines spécifiques, les cristallines. L'indice de réfraction croissant du cortex vers la région nucléaire est associé à l'augmentation de la concentration en cristallines. La région nucléaire, où l'indice de réfraction est le plus haut, est enrichie en γ-cristallines, une famille de polypeptides monomériques synthétisés principalement pendant le développement précoce, qui jouent un rôle important en formant un ensemble de protéines très dense. Cependant, cette concentration élevée est près d'un point critique où les protéines très solubles subissent une séparation de phase, conduite par une concurrence de forces d'interactions protéine-eau, eau-eau et protéine-protéine. Cette séparation de phase est cruciale dans l'opacification des cellules du cristallin trouvée dans certaines formes de cataracte mammifère. Une étude de diffraction de neutrons à haute résolution peut compléter les données existantes aux rayons X et peut nous permettre de faire une analyse détaillée et complète de l'organisation du solvant autour de la γcristalline. Ceci fournira une base structurale pour étudier les interactions protéine-solvant, solvant-solvant et protéine-protéine. Cette étude peut être considérablement facilitée par l'utilisation de la protéine entièrement deutériée. La substitution du deutérium à l'hydrogène réduit le bruit de fond incohérent causé par les hydrogènes, renforçant alors le rapport signal sur bruit. L'échange de l'hydrogène par le deutérium peut être fait en trempant le cristal de protéine dans une solution deutériée mais seulement 25% de hydrogènes totaux de la protéine sont alors échangés. Un échange total peut être uniquement effectué par une biosynthèse protéique in vivo, en utilisant une culture bactérienne dans un milieu deuterié. La γE cristalline de rat a été choisie comme un système modèle pour localiser les atomes d'hydrogène des molécules d'eau entourant la protéine et ceux impliqués dans des intéractions stabilisantes. De grandes quantités de protéines hydrogénées et perdeutériées ont été exprimées dans Escherichia coli, qui a poussé dans un milieu minimal, et elles ont ensuite été purifiées. Par spectrométrie de masse, le niveau de substitution isotopique des hydrogènes non échangeables dans la protéine s'est avéré être de 98%. En l'absence d'activité biochimique connue, les γE cristallines hydrogénées et deutériées ont été caractérisées par gel natif, par détermination du point isoélectrique et par des protéolyses limitées. Il n'y a aucune différence biochimique évidente entre ces formes de la protéine. D'autres caractérisations, par spectroscopie infrarouge et en dichroïsme circulaire, ont été employées pour étudier des différences significatives, mais aucune n'a été décelée. Les protéines hydrogénées et deutériées ont été cristallisées dans des tampons hydrogénés et deutériés. Les conditions de cristallisation, les groupes de l'espace et les paramètres de maille se sont avérés être les mêmes pour toutes les formes de la protéine. La comparaison de ces quatre formes de γE cristalline n'a indiqué aucune différence structurale évidente entre elles à une résolution atomique aux alentours de 1,4Å. Cependant, la variation de facteur d'agitation thermique des structures à une résolution identique (HγEh2o, HγEd2o et DγEh2o) dépend du marquage d'isotopique. Les structures de la protéine deutériée en H2O ou celle hydrogénée avec un tampon D2O ont un facteur d'agitation thermique plus bas. Par la suite, le modèle moléculaire de la γE cristalline a été obtenu à 1,36Å et quelques nouveaux détails étonnants de la protéine et du réseau de molécule d'eau entourant la protéine sont décrits dans ce rapport. Jusqu'à l'amélioration de la taille des cristaux, toute collecte de données par diffraction de neutrons ne peut pas être envisagée, mais d'une manière globale, nous avons prouvé que la perdeutériation n'induisait pas de changement structural de la protéine

Caractérisations biochimiques et structurales de la Gamma E cristalline de rat, hydrogénée et perdeutériée en vue d'une étude de diffraction des neutrons

Tous les cristallins des vertébrés sont transparents et ont un pouvoir de réfraction. Ceci est dû à l'arrangement régulier de cellules et à l'expression différentielle de protéines spécifiques, les cristallines. La gamma E cristalline de rat a été choisie comme un système modèle pour localiser les atomes d'hydrogène des molécules d'eau entourant la protéine et ceux impliqués dans des interactions stabilisantes. Une étude de diffraction de neutrons à haute résolution peut compléter les données existantes aux rayons X et peut permettre une analyse détaillée de l'organisation du solvant autour des gamma cristalline. Ceci fournira une base structurale pour étudier les interactions protéine-solvant, solvant-solvant et protéine-protéine. Cette étude peut être facilitée par l'utilisation de la protéine deutériée. La substitution du deutérium à l'hydrogène réduit le bruit de fond incohérent causé par les hydrogènes. L'échange partiel de l'hydrogène par le deutérium peut être fait en trempant le cristal de protéine dans une solution deutériée. Un échange total peut être uniquement effectué par une biosynthèse protéique in vivo. Les protéines hydrogénées et perdeutériées ont été exprimées dans E. coli, et purifiées. Aucune différence biochimique ou spectrale évidente n'a été trouvée. Les protéines ont été cristallisées et la comparaison des formes de la gamma E cristalline n'a indiqué aucune différence structurale à une résolution de 1,4Å. Jusqu'à l'amélioration de la taille des cristaux, la diffraction de neutrons ne peut pas être envisagée, mais d'une manière globale, nous avons prouvé que la perdeutériation n'induisait pas de changement structural de la protéine.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Structural and Functional Analysis of the Symmetrical Type I Restriction Endonuclease R.EcoR124INT

Type I restriction-modification (RM) systems are comprised of two multi-subunit enzymes, the methyltransferase (,160 kDa), responsible for methylation of DNA, and the restriction endonuclease (,400 kDa), responsible for DNA cleavage. Both enzymes share a number of subunits. An engineered RM system, EcoR124INT, based on the N-terminal domain of the specificity subunit of EcoR124I was constructed that recognises the symmetrical sequence GAAN7TTC and is active as a methyltransferase. Here, we investigate the restriction endonuclease activity of R. EcoR124I NT in vitro and the subunit assembly of the multi-subunit enzyme. Finally, using small-angle neutron scattering and selective deuteration, we present a low-resolution structural model of the endonuclease and locate the motor subunits within the multi-subunit enzyme. We show that the covalent linkage between the two target recognition domains of the specificity subunit is not required for subunit assembly or enzyme activity, and discuss the implications for the evolution of Type I enzymes

Correction: Structural and Functional Analysis of the Symmetrical Type I Restriction Endonuclease R.EcoR124I(NT).

[This corrects the article DOI: 10.1371/journal.pone.0035263.]

Adaptation of extremophilic proteins with temperature and pressure: Evidence from initiation factor 6

In this work, we study dynamical properties of an extremophilic protein, Initiation Factor 6 (IF6), produced by the archeabacterium <i>Methanocaldococcus jannascii</i>, which thrives close to deep-sea hydrothermal vents where temperatures reach 80 °C and the pressure is up to 750 bar. Molecular dynamics simulations (MD) and quasi-elastic neutron scattering (QENS) measurements give new insights into the dynamical properties of this protein with respect to its eukaryotic and mesophilic homologue. Results obtained by MD are supported by QENS data and are interpreted within the framework of a fractional Brownian dynamics model for the characterization of protein relaxation dynamics. IF6 from <i>M. jannaschii</i> at high temperature and pressure shares similar flexibility with its eukaryotic homologue from <i>S. cerevisieae</i> under ambient conditions. This work shows for the first time, to our knowledge, that the very common pattern of <i>corresponding states</i> for thermophilic protein adaptation can be extended to thermo-barophilic proteins. A detailed analysis of dynamic properties and of local structural fluctuations reveals a complex pattern for “corresponding” structural flexibilities. In particular, in the case of IF6, the latter seems to be strongly related to the entropic contribution given by an additional, C-terminal, 20 amino-acid tail which is evolutionary conserved in all mesophilic IF6s

Small-angle neutron scattering of R.EcoR124I_NT.

<p><b>(a)</b> the SANS profile of R.EcoR124I_NT measured in H₂O (blue triangles) and the SANS of the two HsdR subunits <i>in situ</i> from a sample containing deuterated HsdR subunits and protonated MTase, measured in 40% D₂O (red squares). The solid black lines, show the fits from the back-transformed <i>P</i>(<i>r</i>) functions <b>(b)</b> Distance distribution function, <i>P</i>(<i>r</i>), obtained from the scattering profiles shown in (a).</p

DNA cleavage of supercoiled and linear DNA with one or two R.EcoR124I_NT recognition sites.

<p><b>(a)</b> Diagrammatic representation of the DNA substrates used: pUC19 (left) and pTK-neo (right). <b>(b)</b> Restriction assay. The endonuclease was incubated with DNA substrates containing either one or two recognition sites, both supercoiled and linear. Reactions were carried at 37°C and stopped with the addition of 0.5 M EDTA at 1, 5, 15 and 120 minutes. Reactions were run on a 0.8% TBE agarose gel with a 1kb DNA marker (NEB). <b>(c)</b> Densitometry scan of the reaction product of R.EcoR124I_NT incubated with two-site linear DNA. <b>(d)</b> Kinetics of cleavage of supercoiled DNA with two recognition sites (pUC19). Reaction products were analysed on a 0.8% TBE agarose gel. Reactions were carried at 37°C and stopped with the addition of 0.5 M EDTA at the time points shown over the range 10–300 secs. M represents a 1kb DNA marker (NEB). <b>(e)</b> Quantitation of supercoiled DNA (blue), nicked circle (red) and linear DNA (green) over the time-course of the reaction, by analysis of the data shown in (d).</p

Assembly of R.EcoR124I_NT.

<p><b>(a)</b> Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)<b>.</b> A 6% native gel was run at 150 V for 2.5 hours. Final concentrations of MTase and DNA were 2 µM. Lanes labelled R1 and R2 correspond to 1∶1 and 2∶1 molar ratios of HsdR to MTase. No difference was observed in the presence of 10 mM MgCl₂. <b>(b)</b> Dynamic light scattering. The R1 and R2 complexes had hydrodynamic radii of 6.1 and 6.2 nm, respectively. <b>(c)</b> Sedimentation coefficient distributions of R.EcoR124I_NT (the R2 complex) plus and minus DNA. Sedimentation velocity data were collected at 285 nm, scanning every 12 minutes at 10°C at 30,000 rpm. Peak sedimentation coefficients for the free enzyme (9.5 S) and the enzyme bound to DNA (10.6 S) were converted to S_20,w values of 12.6 S and 14.0 S, respectively.</p