Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Salmonella sp. en leche en polvo: Optimización del método en 12 horas

Resumen Los métodos tradicionales para identificar Salmonella sp. se basan en el empleo demedios de cultivo que permiten la recuperación del microorganismo, el aislamiento en medios selectivos, la identificación bioquímica y caracterización serológica. Estos métodos son dispendiosos, tienen baja especificidad, baja sensibilidad y consumen mucho tiempo. El principal objetivo de este trabajo fue estandarizar y optimizar la técnica de PCR para detectar Salmonella sp. en 12 horas, a partir de ADN de cultivos puros y en muestras de leche en polvo, inoculadas intencionalmente con 200, 20 y 2 UFC/mL. Para la extracción del ADN se estudió la conveniencia de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y Chelex® 100. La temperatura de hibridización y las concentraciones de cloruro de magnesio, empleando un diseño factorial incompleto 6x7, permitieron establecer un límite de detección de hasta 10 pg de ADN en cultivos puros de Salmonella typhi. La PCR se basó en la exclusividad de los oligonucleótidos 139-141, los cuales amplificaron una banda de 284 pb para la identificación de género. Los resultados muestran que: (I) la adición de Novobiacina (45 mg/L) o de verde brillante (10 mg/L) como inhibidores de flora acompañante, después de las primeras tres horas del pre-enriquecimiento no selectivo de 6 horas, no influye significativamente en la recuperación de las células bacterianas; (II) obtener biomasa de la primera dilución en base 10 y emplear la técnica de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para la obtención de ADN, se pueden detectar 2 UFC/mL de Salmonella sp. en leche en polvo y que el tiempo de detección se reduce considerablemente. Palabras claves: Salmonella sp., leche en polvo, PCR, diagnóstico molecular, diagnóstico microbiológico, optimización. Abstract The traditional methods to identify Salmonella sp. are based on the culture medium use that allows the recovery of the micro organism, isolation in selective media, biochemical and serologic characterization. These methods are tedious, have a low specificity and sensitivity and they generally consume a long time. The main objective of this study was to standardize and to optimize the PCR technique to detect Salmonella sp. in 12 hours, from DNA of pure cultures and from powdered milk samples, intentionally inoculated with 200, 20 and 2 CFU/mL. For the extraction of DNA, two methods were used: phenol:chloroform:isoamyl alcohol and chelex® 100. The optimization of the temperature of hibridización and the concentrations of Magnesium Chloride, using an incomplete factorial desing 6x7 allowed to establish a detection limit of up to 10 pg of DNA from pure cultures of Salmonella typhi. The PCR was based on the specificity of oligonucleotidos the 139-141, that amplified a band of 284 pb for the gender identification. The results show that: (I) the inhibitor addition of accompanying flora like Novobiocin (45 mg/L) or brilliant green (10 mg/L) as inhibitors of accompanying flora, after the first three hours in the nonselective pre-enrichment of 6 hours, does not significantly influence in the recovery of the bacterial cells, (II) when obtaining biomass of the first dilution in base 10 and using the phenol:chloroform:isoamyl alcohol technique for the extraction of DNA; can be detected 2 CFU/mL Salmonella s.p. from powdered milk and that the PCR technique reduces the time of test considerably. Key words: Salmonella sp., powdered milk, PCR, molecular diagnosis, microbiologist diagnosis, optimization

Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Salmonella sp. en leche en polvo: Optimización del método en 12 horas

Resumen Los métodos tradicionales para identificar Salmonella sp. se basan en el empleo demedios de cultivo que permiten la recuperación del microorganismo, el aislamiento en medios selectivos, la identificación bioquímica y caracterización serológica. Estos métodos son dispendiosos, tienen baja especificidad, baja sensibilidad y consumen mucho tiempo. El principal objetivo de este trabajo fue estandarizar y optimizar la técnica de PCR para detectar Salmonella sp. en 12 horas, a partir de ADN de cultivos puros y en muestras de leche en polvo, inoculadas intencionalmente con 200, 20 y 2 UFC/mL. Para la extracción del ADN se estudió la conveniencia de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y Chelex® 100. La temperatura de hibridización y las concentraciones de cloruro de magnesio, empleando un diseño factorial incompleto 6x7, permitieron establecer un límite de detección de hasta 10 pg de ADN en cultivos puros de Salmonella typhi. La PCR se basó en la exclusividad de los oligonucleótidos 139-141, los cuales amplificaron una banda de 284 pb para la identificación de género. Los resultados muestran que: (I) la adición de Novobiacina (45 mg/L) o de verde brillante (10 mg/L) como inhibidores de flora acompañante, después de las primeras tres horas del pre-enriquecimiento no selectivo de 6 horas, no influye significativamente en la recuperación de las células bacterianas; (II) obtener biomasa de la primera dilución en base 10 y emplear la técnica de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para la obtención de ADN, se pueden detectar 2 UFC/mL de Salmonella sp. en leche en polvo y que el tiempo de detección se reduce considerablemente. Palabras claves: Salmonella sp., leche en polvo, PCR, diagnóstico molecular, diagnóstico microbiológico, optimización. Abstract The traditional methods to identify Salmonella sp. are based on the culture medium use that allows the recovery of the micro organism, isolation in selective media, biochemical and serologic characterization. These methods are tedious, have a low specificity and sensitivity and they generally consume a long time. The main objective of this study was to standardize and to optimize the PCR technique to detect Salmonella sp. in 12 hours, from DNA of pure cultures and from powdered milk samples, intentionally inoculated with 200, 20 and 2 CFU/mL. For the extraction of DNA, two methods were used: phenol:chloroform:isoamyl alcohol and chelex® 100. The optimization of the temperature of hibridización and the concentrations of Magnesium Chloride, using an incomplete factorial desing 6x7 allowed to establish a detection limit of up to 10 pg of DNA from pure cultures of Salmonella typhi. The PCR was based on the specificity of oligonucleotidos the 139-141, that amplified a band of 284 pb for the gender identification. The results show that: (I) the inhibitor addition of accompanying flora like Novobiocin (45 mg/L) or brilliant green (10 mg/L) as inhibitors of accompanying flora, after the first three hours in the nonselective pre-enrichment of 6 hours, does not significantly influence in the recovery of the bacterial cells, (II) when obtaining biomass of the first dilution in base 10 and using the phenol:chloroform:isoamyl alcohol technique for the extraction of DNA; can be detected 2 CFU/mL Salmonella s.p. from powdered milk and that the PCR technique reduces the time of test considerably. Key words: Salmonella sp., powdered milk, PCR, molecular diagnosis, microbiologist diagnosis, optimization