Dualsterische Liganden, allosterische Agonisten und ein allosterischer Förderer der Agonist-Bindung und -Funktion : Modellgestützte Analysen ihrer Rezeptorinteraktionen, Signalweg-Aktivierungen und -Selektivitäten an Wildtyp und punktmutierten <em>h</em>M₁-Rezeptoren in CHO-Zellen

Dualsterische Hybridliganden, bestehend aus einem allosterischen und einem orthosterischen Baustein, die über eine Zwischenkette verbundenen sind, gelten als ideale Werkzeuge zur Entwicklung subtyp- und signalwegselektiver Liganden. Abhängig von den Bindungsneigungen der einzelnen Bausteine zu den für sie vorgesehenen Bindungsstellen, können diese Liganden entweder in einer dualsterischen oder in einer rein allosterischen Bindungsorientierung mit dem Rezeptorprotein interagieren. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals an muskarinischen hM1-Rezeptoren der dynamische Wechsel zwischen der dualsterischen und der rein allosterischen Bindungsorientierung dualsterischer Hybridliganden, als ein Werkzeug zum Design von neuen Partialagonisten identifiziert werden, die einen neuen Ansatz für die Entwicklung von Arzneistoffen zur Behandlung von M. Alzheimer bilden können. Für die Charakterisierung der unterschiedlichen Bindungsorientierungen der zu untersuchenden Hybridliganden konnten in der vorliegenden Arbeit erstmals zwei Gleichungen für die Datenanalyse Anwendung finden, die den Erkenntisrahmen ihrer Vorgängerversionen substanziell erweiterten. Die zusätzliche Einbeziehung funktioneller Daten führte zu der Entwicklung einer neuen globalen Datenanalysevariante auf Basis des „Operational model of agonism for dynamic ligands“ die es erlaubte, die bislang bei Einzelkurvenbetrachtung durch Überparametrisierung analytisch unzugängliche Parameter τmax und εmax zu bestimmen. Dieses Vorgehen ermöglichte es erstmalig, für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Hybridliganden mit εmax*, den systemunabhängigen Transduktionskoeffizienten bei 100% dualsterischer Rezeptorbindung in Abwesenheit einer Rezeptorreserve zu bestimmen und deren signifikanten Unterschied als potentielle Erklärung für die, trotz signifikant unterschiedlicher aktiver dualsterischer Bindungsorientierung bei einem Hybridpaar auf allen untersuchten Signalwegen (mit Ausnahme des durch Gi Proteine vermittelten Signalweges), gleich ausgeprägten Maximaleffekte Emax zu erklären: eine höherer Wert für εmax* kompensiert die durch eine geringere dualsterische Bindungsorientierung induzierte geringere aktive Rezeptorfraktion (dualsterische Bindung). Die Wirksamkeitsbetrachtung dualsterischer Liganden kann zukünftig demnach neben Emax und Rpose nach den Befunden der vorliegenden Arbeit auch deren rezeptorvermittelte maximale intrinsische Aktivität εmax* einschließen. Um weitere Einblicke in das Bindungsverhalten und die Signalwegaktivierung der dualsterischen Hybridliganden dieser Arbeit zu erlangen, wurde erstmals der Einfluss unterschiedlicher Mutationen im Bereich der putativ allosterischen Bindungsstelle des humanen hM1-Rezeptors untersucht. Zudem sollte überprüft werden, ob die Hybridliganden eine Ligand-spezifische Bevorzugung eines speziellen Signalweges induzieren. Auf diese Weise konnten Einblicke darüber gewonnen werden, welche Aminosäuren möglicherweise an der ligandvermittelten Bindung unterschiedlicher G Proteine sowie der Ausbildung unterschiedlicher Rezeptorkonformationen beteiligt sind. Neben seiner Muttersubstanz BQCA konnte auch erstmalig für den allosterische Baustein UR-MD-5 (BQCAd) im Rahmen dieser Arbeit in Gleichgewichtsbindungsexperimenten an hM1-Rezeptoren eine positive Kooperativität mit dem Agonisten [3H]Iperoxo nachgewiesen werden. Das um sieben Kohlenstoffatome längere allosterische Fragment UR-MD-6 (BQCAd) zeigte unter identischen Bedingungen eine negative Kooperativität mit [3H]Iperoxo. Somit konnte nachgewiesen werden, dass allein die Verlängerung des Alkylsubstituenten einen Wechsel der allosterischen Modulationsrichtung der Agonistbindung von positiv (PAM) zu negativ (NAM) bewirken kann. Zusätzlich durchgeführte funktionelle Experimente zeigten, dass UR-MD-5 zwar als ein positiv allosterischer Modulator hinsichtlich der [3H]Iperoxo-Gleichgewichtsbindung, jedoch als ein „stiller“ allosterischer Modulator (SAM) hinsichtlich der durch Iperoxo induzierten Gq Protein-vermittelten und als ein positiv allosterischer Modulator hinsichtlich der durch Iperoxo induzierten Gs Protein-vermittelten Rezeptoraktivierung fungiert. Auf der Suche nach selektiven Aktivatoren muskarinischer M1-Rezeptoren, konnte in der Literatur bereits eine Reihe von Substanzen als „allosterische Agonisten“ identifiziert werden. Für einige der dort als „allosterische Agonisten“ am muskarinischen M1-Rezeptor identifizierte Liganden, darunter auch die Substanz TBPB, konnte hinsichtlich ihrer Bindungstopographie nicht ausgeschlossen werden, dass es sich um einen „bitopischen“ Bindungsmodus handelt. In kinetischen Experimenten zeigte das allosterische Fragment UR-MD-2 (TBPBd) die Fähigkeit, am Flp-hM1-Rezeptor die Dissoziation des Radioantagonisten [3H]NMS zu verzögern und lieferte damit einen Beleg für eine allosterische Rezeptorinteraktion innerhalb eines ternären Komplexes (hM1/UR-MD-2/NMS). In Gleichgewichtsbindungsexperimenten zeigte UR-MD-2 als TBPBd, anders als für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten allosterischen Fragmente vom Typ BQCAd, eine formal vollständige Inhibition der spezifischen [3H]NMS-Bindung als Ausdruck einer stark negativen Kooperativität mit [3H]NMS oder aber einer Interaktion mit Bereichen der orthosterischen Bindungsstelle. Untersuchungen unterschiedlicher Mutationen im Bereich der putativ allosterischen Bindungsstelle zeigten weitere Besonderheiten hinsichtlich der Bindungseigenschaften von UR-MD-2 (TBPBd) und lieferten weitere Hinweise auf eine Interaktion sowohl mit der allosterischen als auch mit Bereichen der orthosterischen Bindungsstelle. Zusammenfassend ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, viele verschiedenartige Mechanismen der Ligand-Rezeptor-Interaktion wesentlich zu erhellen bzw. aufzudecken, die sowohl bei der Entwicklung neuer dualsterischer Liganden, als auch allosterischer Modulatoren eine Rolle spielen können

Novel BQCA‐ and TBPB‐Derived M 1 Receptor Hybrid Ligands: Orthosteric Carbachol Differentially Regulates Partial Agonism

Recently, investigations of the complex mechanisms of allostery have led to a deeper understanding of G protein-coupled receptor (GPCR) activation and signaling processes. In this context, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) are highly relevant due to their exemplary role in the study of allosteric modulation. In this work, we compare and discuss two sets of putatively dualsteric ligands, which were designed to connect carbachol to different types of allosteric ligands. We chose derivatives of TBPB [1-(1 '-(2-tolyl)-1,4 '-bipiperidin-4-yl)-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one] as M-1-selective putative bitopic ligands, and derivatives of benzyl quinolone carboxylic acid (BQCA) as an M-1 positive allosteric modulator, varying the distance between the allosteric and orthosteric building blocks. Luciferase protein complementation assays demonstrated that linker length must be carefully chosen to yield either agonist or antagonist behavior. These findings may help to design biased signaling and/or different extents of efficacy

Carbachol dimers with primary carbamate groups as homobivalent modulators of muscarinic receptors

Although agonists and antagonists of muscarinic receptors have been known for long time, there is renewed interest in compounds (such as allosteric or bitopic ligands, or biased agonists) able to differently and selectively modulate these receptors. As a continuation of our previous research, we designed a new series of dimers of the well-known cholinergic agonist carbachol. The new compounds were tested on the five cloned human muscarinic receptors (hM1-5) expressed in CHO cells by means of equilibrium binding experiments, showing a dependence of the binding affinity on the length and position of the linker connecting the two monomers. Kinetic binding studies revealed that some of the tested compounds were able to slow the rate of NMS dissociation, suggesting allosteric behavior, also supported by docking simulations. Assessment of ERK1/2 phosphorylation on hM1, hM2 and hM3 activation showed that the new compounds are endowed with muscarinic antagonist properties. At hM2 receptors, some compounds were able to stimulate GTP\u3b3S binding but not cAMP accumulation, suggesting a biased behavior. Classification, Molecular and cellular pharmacology

Rational Design of Partial Agonists for the Muscarinic M-1 Acetylcholine Receptor

Aiming to design partial agonists for a G-protein-coupled receptor based on dynamic ligand binding, we synthesized three different series of bipharmacophoric ligands composed of the orthosteric building blocks iperoxo and 1 linked to allosteric modulators (BQCA-derived compounds, BQCAd; TBPB-derived compound, TBPBd). Their interactions were studied with the human muscarinic acetylcholine M-1-receptor (hM(1)) with respect to receptor binding and G(q)-protein signaling. Results demonstrate that iperoxo/BQCAd (2, 3) and 1/BQCAd hybrids (4) act as M1 partial agonists, whereas 1/TBPBd hybrids (5) did not activate M-1-receptors. Among the iperoxo/BQCAd-hybrids, spacer length in conjunction with the pattern of substitution tuned efficacy. Most interestingly, a model of dynamic ligand binding revealed that the spacer length of 2a and 3a controlled the probability of switch between the inactive purely allosteric and the active bitopic orthosteric/allosteric binding pose. In summary, dynamic ligand binding can be exploited in M-1 receptors to design partial agonists with graded efficacy

Global Alliance for the Promotion of Physical Activity: the Hamburg Declaration

Non-communicable diseases (NCDs), including coronary heart disease, stroke, hypertension, type 2 diabetes, dementia, depression and cancers, are on the rise worldwide and are often associated with a lack of physical activity (PA). Globally, the levels of PA among individuals are below WHO recommendations. A lack of PA can increase morbidity and mortality, worsen the quality of life and increase the economic burden on individuals and society. In response to this trend, numerous organisations came together under one umbrella in Hamburg, Germany, in April 2021 and signed the ‘Hamburg Declaration’. This represented an international commitment to take all necessary actions to increase PA and improve the health of individuals to entire communities. Individuals and organisations are working together as the ‘Global Alliance for the Promotion of Physical Activity’ to drive long-term individual and population-wide behaviour change by collaborating with all stakeholders in the community: active hospitals, physical activity specialists, community services and healthcare providers, all achieving sustainable health goals for their patients/clients. The ‘Hamburg Declaration’ calls on national and international policymakers to take concrete action to promote daily PA and exercise at a population level and in healthcare settings