Mechanismen des Chromatin-Remodellings am Beispiel der molekularen Smyd1-PML-SUMO1-Achse

Die vorliegende Arbeit hat das Ziel, das zellphysiologische Wirkungsspektrum der molekularen Smyd1-PML-SUMO1-Achse im Rahmen des Chromatin-Remodellings zu beschreiben, die in meiner Forschung u.a. mittels umfangreicher Transfektionsversuche mit Vektoren bzw. siRNA sowie ChIP-Analysen und biologischen Assays identifiziert wurden. Im Mittelpunkt der Darstellung steht dabei die molekulare Charakterisierung von drei Funktionsmodulen, an denen Smyd1 in kultivierten Myoblasten, Endothelzellen oder Glattmuskelzellen sowie in Gefäßabschnitten von Arteriosklerose- und Nicht-Arteriosklerose-Patienten beteiligt ist: 1. Smyd1 als Kofaktor der Transkription, 2. Smyd1 als Histonmethyltransferase (HMT) und 3. Smyd1 in Interaktion mit PML zur Organisation der SUMOylierungsfabriken PML-Kernkörperchen. Dabei wurde herausgefunden, dass 1. Smyd1 im Komplex mit dem Muskel-spezifischen Transkriptionsfaktor skNAC die Transkription ausgewählter Gene in differenzierten Myoblasten induziert, die zur Myofibrillogenese, zu Entzündungsvorgängen und zum Zellstoffwechsel beitragen. 2. Smyd1 in humanen Endothelzellen nach Exposition mit Lipopolysacchariden (LPS) die Produktion und Sekretion von IL-6 erhöht. Die Umsetzung erfolgt entweder über Trimethylierung des Lysin 4 des Histons 3 im Bereich des IL-6 Promotors als auch indirekt über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB. 3. Smyd1 die eigene Konzentration in Endothelzellen durch einen negativen Feedbackmechanismus mit negativer Rückkopplung beeinflusst. Dieser Mechanismus umfasst die Induktion der PML-Expression auf mRNA- und Proteinebene, den Transport des PML in den Nucleus und den vermehrten Zusammenbau von PML-NBs, wodurch zunächst PML und dann Smyd1 SUMOyliert werden. Hierdurch wiederum wird Smyd1 für den Transport ins Zytoplasma und den abschließenden proteosomalen Abbau markiert. Dass die SUMOylierung nicht nur ein Degradationssignal ist, sondern auch funktionell relevant sein kann, wird in Koronargefäßen von Arteriosklerose-Patienten gezeigt, in denen SUMOyliertes PML zum Phänotypwechsel (‚Phenotypic Switch’) von glatten Muskelzellen beiträgt, so wie sie typisch für diese Zellen in arteriosklerotischen Plaques ist. Es wurden Faktoren identifiziert (IFN-gamma, TNF-alpha, LPS), die an unterschiedlichen Schnittstellen zur Regulation der Smyd1-Konzentration in der untersuchten Endothelzelllinie einwirken. Die experimentellen Daten belegen, dass Smyd1 ein multifunktionales Molekül ist, das an verschiedenen molekularen funktionellen Modulen beteiligt ist und dabei über SUMOylierung und HMT-Aktivität wirkt

The Methyltransferase Smyd1 Mediates LPS-Triggered Up-Regulation of IL-6 in Endothelial Cells

The lysine methyltransferase Smyd1 with its characteristic catalytic SET-domain is highly enriched in the embryonic heart and skeletal muscles, participating in cardiomyogenesis, sarcomere assembly and chromatin remodeling. Recently, significant Smyd1 levels were discovered in endothelial cells (ECs) that responded to inflammatory cytokines. Based on these biochemical properties, we hypothesized that Smyd1 is involved in inflammation-triggered signaling in ECs and therefore, investigated its role within the LPS-induced signaling cascade. Human endothelial cells (HUVECs and EA.hy926 cells) responded to LPS stimulation with higher intrinsic Smyd1 expression. By transfection with expression vectors containing gene inserts encoding either intact Smyd1, a catalytically inactive Smyd1-mutant or Smyd1-specific siRNAs, we show that Smyd1 contributes to LPS-triggered expression and secretion of IL-6 in EA.hy926 cells. Further molecular analysis revealed this process to be based on two signaling pathways: Smyd1 increased the activity of NF-kappa B and promoted the trimethylation of lysine-4 of histone-3 (H3K4me3) within the IL-6 promoter, as shown by ChIP-RT-qPCR combined with IL-6-promoter-driven luciferase reporter gene assays. In summary, our experimental analysis revealed that LPS-binding to ECs leads to the up-regulation of Smyd1 expression to transduce the signal for IL-6 up-regulation via activation of the established NF-κB pathway as well as via epigenetic trimethylation of H3K4

The skNAC-Smyd1 complex: a multifunctional regulator of myogenesis?

Die Skelett- und Herzmuskel spezifische Variante der α-Untereinheit des Nascent-associated-complex (skNAC) sowie dessen Interaktionspartner, das SET- umd MYND-Domänen enthaltene Smyd1-Protein werden ausschliesslich im quergestreiften Muskel exprimiert. Beiden Proteinen wird dabei aufgrund im Vorfeld der Arbeit veröffentlichten Publikationen eine entscheidene Rolle bei der Myogenese zugeschrieben. Dabei handelt es sich um einen komplexen und hoch organisierten Prozess, durch den während der Embryonalentwicklung oder auch durch spätere äußere Einflüsse, wie beispielsweise nach Verletzung, differenzierte Muskelfasern, mit streng strukturierten Sarkomeren, entstehen und der durch eine Vielzahl von Proteinen genau zeitlich und räumlich gesteuert wird. Um die implizierten Funktionen von skNAC und Smyd1 im Skelettmuskel sowie deren eigentlichen Mechanismus detaillierter in Säugetieren zu analysieren, wurden in der vorliegenden Arbeit eine Reihe an unterschiedlichen Experimenten durchgeführt. In einem ersten Schritt konnte gezeigt werden, dass skNAC, wie bereits im Vorfeld für Smyd1 demonstriert, auf transkriptioneller Ebene reguliert wird, wobei der p38-Signalweg dabei eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Interessanterweise konnte nach Hemmung der skNAC-Expression in murinen Myoblasten kein Einfluss auf das Differenzierungsverhalten der Zellen nachgewiesen werden, dargestellt durch die Analyse bekannter Differenzierungsmarker auf RNA, als auch auf Proteinebene. Jedoch konnte nach knockdown der skNAC-Expression, ähnlich wie bereits für skNAC und Smyd1 im Zebrafischmodellsystem gezeigt, ein Effekt auf die Sarkomerogense in den verwendeten Säugetierzellen beobachtet werden. Dieser war gekennzeichnet durch eine gestörte Anordnung der dicken (Myosin-) und dünnen (Aktin-) Filamente. Auf der Suche nach dem Mechanismus der für den beobachteten Phänotyp verantwortlich sein könnte, wurde das Expressionsmuster einer Reihe von Chaperonen und Ubiquitin-Ligasen nach Hemmung der skNAC- Expression untersucht, deren Funktionen im Zusammenhang mit der Myofibrillogenese bereits bekannt sind. Dabei konnten das Calpain 1- und 3-Gen als mögliche Kandidaten identifiziert werden. Deren Transkript- als auch Aktivitätslevel waren nach Unterdrückung der skNAC-Expression vor allem für Calpain 1 signifikant erhöht. Eine Behandlung der skNAC-siRNA-transfizierten Zellen mittels eines spezifischen Calpaininhibitors verdeutlichte, dass tatsächlich Calpaine eine Rolle bei den beobachteten Effekten spielen könnten, da die Behandlung dazu führte, dass skNAC-defiziente Zellen nicht mehr von Wildtyp-Zellen zu unterscheiden waren. Da zudem ein Zusammenhang zwischen Calpainen und Migrationsvorgängen bekannt ist, wurde außerdem untersucht, ob möglicherweise auch skNAC-defiziente Zellen ein verändertes Migrationspotential aufweisen. Dies war tatsächlich zu beobachten. Auch in diesem Fall konnte durch die Zugabe des Calpaininhibitors ein Migrationspotential wiederhergestellt werden, dass dem der Kontrollzellen entsprach. Aufgrund vorangegangener Publikationen wird angenommen, dass sowohl skNAC als auch Smyd1 als Transkriptionsfaktoren bzw. zumindest als transkriptionelle Aktivatoren agieren. Bisher konnten diese Annahme jedoch noch nicht eindeutig belegt werden. Ferner sind auch nur wenige spezifischen Targetgene beider Proteine beschrieben. Um potentielle Zielgene von skNAC zu identifizieren, wurde daher ein cDNA-Microarray nach Inhibierung der skNAC- Expression in kultivierten, differenzierenden Myoblasten durchgeführt. Unter den analysierten Genen befanden sich dabei auffällig viele Gene, die vor allem im Kontext mit der Immunantwort bekannt sind. Überraschenderweise konnte das Myoglobin-Gen nicht als differentiell exprimiertes Gen ermittelt werden. Überraschend aufgrund der Tatsache, dass vorherige Studien u.a. darlegen, dass skNAC die Myoglobin-Promotoraktivität stimulieren kann. Insgesamt weisen die in den C2C12-Zellen gewonnen Daten nach Inhibierung der skNAC-Expression, zum Teil kontrovers zu vorherigen Publikationen, darauf hin, dass skNAC die Verschiebung hin zu Fasern mit einem eher glykolytischen Metabolismus fördert. Des Weiteren liefert die Studie erstmals Hinweise darauf, dass als möglicher molekulare Mechanismus, durch den der skNAC-Smyd1-Komplex die Expression spezifischer Gene beeinflusst, Histonmethylierungen und Acetylierungen in Frage kommen könnten. Die bisher dargestellten Daten verdeutlichen, dass skNAC und Smyd1 unterschiedliche Funktionen in der Zelle erfüllen. Auch die Tatsache, dass beide Proteine im Verlauf der Differenzierung eine Translokation aus dem Kern ins Zytosol durchlaufen, untermauert, dass es sich bei diesen vermutlich um multifunktionale Proteine handelt. Über den Mechanismus der die Translokation beider Proteine steuert, war vor Beginn der vorgelegten Studie noch nichts bekannt. Erste Anhaltspunkte wurden dabei durch die Ergebnisse eines Hefe-2-Hybrid-Screens erlangt, bei dem neben anderen potentiellen Interaktionspartnern eine E3-SUMO-Ligase namens Nse2 identifiziert werden konnte. Diese ist Bestandteil eines aus drei enymatischen Schritten bestehenden posttranslationalen Modifizierungsprozesses, welcher als Sumoylierung bezeichnet wird. Eine wichtiger Vorgang in der Zelle, der durch Sumoylierung gesteuert wird, stellt der Transportprozess in und aus dem Zellkern dar. Tatsächlich führte die Unterdrückung der Nse2-Expression, neben Hemmung des Differenzierungspotentials der C2C12-Zellen, zu einem gestörten Transport von Smyd1 und skNAC aus dem Nukleus in das Zytosol. Ein ähnliches Phänomen konnte im weiteren Verlauf auch nach Hemmung der globalen Sumoylierung beobachtet werden. Ferner konnte in der Studie demonstriert werden, dass Smyd1 im Skelettmuskel ein Sumoylierungssubstrat darstellt. Sumoylierung spielt somit vermutlich eine wichtige Rolle bei der Steuerung der nuklearen und zytosolischen Funktionen von skNAC und Smyd1. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, skNAC im Kontext mit muskulären Erkrankungen, speziell im Zusammenhang mit der Pathogenese von Rhabdomyosarkomen, zu untersuchen. Rhabdomyosarkome stellen die häufigsten Weichteiltumore im Kindesalter dar und leiten sich hauptsächlich von entarteten Vorläuferzellen des Muskelgewebes ab. Als Ausgangsmaterial der Studie dienten verschiedene bereits gut charakterisierte Rhabdomyosarkomzelllinien, die sich aufgrund ihres Ursprungs, ihrer genetischen Aberrationen, ihres Differenzierungsverhalten und bezüglich ihrer Malignität unterscheiden lassen. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse der Studie zum einen, dass die skNAC-Expression nicht in allen untersuchten Rhabdomyosarkomzellen induziert wird, wie es normalerweise in nichttransformierten Myoblasten der Fall ist. Zum anderen konnten sie darstellen, dass bei solchen Zelllinien, die kein hohes Basallevel an skNAC nach Initiieren des Differenzierungsvorganges aufweisen, ein Einbringen von skNAC zu einer Steigerung des Differenzierungspotentials führt, welches parallel mit einer gehemmten Proliferation einhergeht. Zudem konnte nach Rekonstitution von skNAC ein Verlust der Malignität in solchen Zellen beobachtet werden, ein wichtiger Befund, der möglicherweise einen neuen therapeutischen Ansatz impliziert.Skeletal and heart muscle-specific variant of the α subunit of nascent polypeptide associated complex (skNAC) and its interaction partner, the SET and MYND domain containing Smyd1 protein are exclusively found in striated muscle cells. Prior to this study, several reports had demonstrated that both proteins regulate myogenesis i.e. the process of new muscle formation, either during embryonic development or in response to injury. Myogenesis is a complex and tightly organized process during which, in response to external stimuli, differentiated muscle fibers with structured sarcomeres develop. The aim of this study was to mechanistically analyze the function of skNAC and Smyd1 in myogenesis. Initially, it was shown that skNAC, like Smyd1 expression, is regulated at the transcriptional level during differentiation of cultured myoblasts, with the p38 MAPK signal transduction pathway playing an important role. However, after inhibition of skNAC expression in these cells, no effect on their differentiation behaviour could be observed. Nevertheless - similar to findings of others in the zebrafish system – it could be demonstrated that knockdown of skNAC expression has an effect on sarcomerogenesis, i.e. the formation and development of new sarcomeres. This effect was characterized by a disturbed assembly of thick (myosin) and thin (actin) filaments in the skNAC-deficient cells. In search of the mechanisms which could be responsible for this phenotype, the expression levels of various genes encoding proteins known to be involved in sarcomerogenesis were analyzed after inhibition of skNAC expression. And indeed, upregulation of calpain 1 and calpain 3 gene expression could be observed after inhibition of skNAC expression. Consistently, treatment of skNAC-knockdown cells with a specific calpain inhibitor revealed that skNAC controls sarcomere architecture in a calpain- dependent manner. Since calpains are known to be potent inducers of myoblast migration, it was furthermore tested whether manipulation of skNAC gene expression affects myoblast migration. This was de facto the case: skNAC- deficient cells were characterized by strongly enhanced myoblast migration rates when compared to control cells, which was - like the effects on sarcomerogenesis - a consequence of the elevated calpain activity seen in these cells. In other previous publications a function of skNAC and Smyd1 as transcription factors or at least as transcriptional co-activators had been suggested prior to this study. However, their mechanism of action in regulating transcription and also probably most of their target genes were largely enigmatic at the beginning of this study. Thus, to identify novel skNAC target genes, we carried out cDNA microarray analysis after inhibiting skNAC expression in cultured, differentiating myoblasts. Remarkably, a high proportion of the differentially expressed genes that were identified corresponded to genes encoding regulators of inflammation. Surprisingly, however, no negative effect on myoglobin gene expression could be observed, although earlier studies had demonstrated that skNAC can stimulate transcription from the myoglobin promoter. Consistently, we also observed upregulation of other genes associated with an oxidative myofiber phenotype in the skNAC-depleted cells. Thus, our data, contradictory to previously published results, indicate that skNAC promotes fiber type changes directed towards a more glycolytic metabolism. In addition, with regard to a potential mechanism of transcriptional control by the skNAC-Smyd1 complex, we provide evidence indicating that the two proteins might modulate histone methylation and histone (de)acetylation patterns in myoblasts. These data suggested that skNAC and Smyd1, potentially as a complex, might act as multifunctional proteins. In addition, the fact that both proteins undergo nuclear-to- cytoplasmic translocation during myogenesis supports the idea that they fulfill specific functions in both subcellular compartments. However, the mechanism that controls this translocation was largely unknown at the beginning of this study. Interestingly it could be shown that skNAC binds to the E3 SUMO ligase Nse2, which was initially identified via a yeast-two-hybrid screen using a C-terminal skNAC fragment as a bait. E3 SUMO ligases catalyze the attachment of a small SUMO protein to a target protein. This post- translational modification, called sumoylation, is known to be involved in various cellular processes, including the regulation of nucleocytoplasmic shuttling. Indeed, knockdown of Nse2 expression in cultured, differentiating myoblasts led to a partial blockade of the nuclear-to cytoplasmic- translocation of the skNAC-Smyd1 complex, accompanied by inhibition of specific aspects of myogenic differentiation. Consistently, a similar effect could be observed after inhibition of global protein sumoylation. In addition, we could show that Smyd1 is a sumoylation substrate in skeletal muscle cells. These data suggest that sumoylation might play an important role in regulating skNAC-Smyd1 functions by controlling the balance between nuclear and cytosolic localization of this protein complex. Finally, another aim of this study was to investigate a potential role of skNAC in skeletal muscle diseases, specifically a possible link between skNAC and the pathogenesis of rhabdomyosarcoma. Rhabdomyosarcoma is the most common sporadic soft-tissue sarcoma of childhood. It is assumed that the respective tumors might originate from mesenchymal stem cells of the myogenic lineage. In this study, selected, well-characterized rhabdomyosarcoma cell lines, which differ in their origin, their genetic aberrations, their differentiation behavior and their metastatic potential, were used to analyze skNAC expression after the induction of myogenic differentiation. Interestingly on the one hand, we could demonstrate that in contrast to normal, non-transformed myoblasts, some of the tested rhabdomyosarcoma cell lines lack inducible skNAC expression. Furthermore, we could show that overexpression of skNAC in specific rhabdomyosarcoma cell lines leads to upregulation of specific myogenic differentiation markers, accompanied by a reduced cell proliferation and a loss of metastatic potential, a finding which might have important therapeutic implications in the future

LDL Affects the Immunomodulatory Response of Endothelial Cells by Modulation of the Promyelocytic Leukemia Protein (PML) Expression via PKC

In addition to its function as an intravascular lipid transporter, LDL also triggers signal transduction in endothelial cells (ECs), which, among other things, trigger immunomodulatory cascades, e.g., IL-6 upregulation. However, the molecular mechanisms of how these LDL-triggered immunological responses in ECs are realized are not fully understood. Since promyelocytic leukemia protein (PML) plays a role in promoting inflammatory processes, we examined the relationship between LDL, PML, and IL-6 in human ECs (HUVECs and EA.hy926 cells). RT-qPCR, immunoblotting, and immunofluorescence analyses showed that LDL but not HDL induced higher PML expression and higher numbers of PML-nuclear bodies (PML-NBs). Transfection of the ECs with a PML gene-encoding vector or PML-specific siRNAs demonstrated PML-regulated IL-6 and IL-8 expression and secretion after LDL exposure. Moreover, incubation with the PKC inhibitor sc-3088 or the PKC activator PMA showed that LDL-induced PKC activity leads to the upregulation of PML mRNA and PML protein. In summary, our experimental data suggest that high LDL concentrations trigger PKC activity in ECs to upregulate PML expression, which then increases production and secretion of IL-6 and IL-8. This molecular cascade represents a novel cellular signaling pathway with immunomodulatory effects in ECs in response to LDL exposure