Molekulare Regulationsmechanismen der connective tissue growth factor (CTGF) Expression in Endothelzellen unter Hypoxie

Hypoxia leads to stabilisation of hypoxia inducible factor (HIF)-1a, which induces a number of genes involved in different biological processes including erythropoiesis and angiogenesis. Angiogenesis is essential in wound healing and in numerous pathologies e.g. diabetic retinopathy, psoriasis, and tumour growth. Connective tissue growth factor (CTGF) modulates different steps of angiogenesis via the interaction with growth factors, integrins and extracellular matrix components, but its regulation by hypoxia is poorly understood. Therefore, the aim of the present study was to investigate the signalling pathways involved in the regulation of CTGF by hypoxia in endothelial cells. This study focused on the analyses of transcripion factors of FoxO family, namely, FoxO1 and FoxO3a. Furthermore the PI3K/AKT, MAPK, RhoA/ROCK and Smad signalling pathways were investigated. Exposure to low oxygen tension or treatment with the hypoxia-mimetic dimethyloxalyl glycine (DMOG) stabilized HIF-1a and upregulated CTGF in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and in a murine microvascular endothelial cell line (glEND.2). Induction of CTGF correlated with a HIF-dependent increase in protein and mRNA levels, and nuclear accumulation of the transcription factor FoxO3a. By contrast, gene expression of FoxO1 was not significantly altered by hypoxia. Expression of CTGF was strongly reduced by siRNA silencing of FoxO1 or FoxO3a. Furthermore, nuclear exclusion of FoxO1/3a transcription factors by inhibition of serine/threonine protein phosphatases by okadaic acid inhibited CTGF expression, providing evidence that both FoxO proteins are regulators of CTGF expression. Involvement of FoxO1/3a in the regulation of CTGF expression was also observed in endothelial cells cultured unter normoxic conditions upon inhibition of PI3K/AKT signalling. Exposure of endothelial cells to LY294002, an inhibitor of PI3K, led to nuclear accumulation of FoxO1/3a and as a result to induction of CTGF. This inductive effect was strongly inhibited by FoxO1/3a siRNA. While PI3K/AKT signalling was essential for the regulation of CTGF expression in endothelial cells unter both normoxic and hypoxic conditions, MAPK and RhoA/ROCK signalling pathways were only partially involved in DMOG-inducible CTGF expression. TGF-b1 induced the expression of CTGF via activation of both Smad2 and Smad3 transcription factors, whereas only Smad2 was important for the DMOG-induced CTGF expression. The DMOG-induced CTGF expression was further increased when endothelial cells were co-incubated with TGF-b1, indicating cooperation between different signalling pathways. The relevance of DMOG-mediated CTGF induction for angiogenesis was investigated using an in vitro three dimensional spheroid model of sprouting angiogenesis. Endothelial cells embedded as spheroids in collagen gels formed capillary-like structures (sproutings) upon treatment with DMOG. DMOG-mediated sproutformation was strongly reduced by downregulation of CTGF using siRNA. This indicates that CTGF is essential for DMOG-induced sprouting angiogenesis. In summary, the data of the present study showed that hypoxia- or DMOG-stimulated expression and nuclear accumulation of FoxO3a, as well as transcription factors FoxO1 and Smad2 are required for induction of CTGF in endothelial cells under hypoxic conditions. First evidence of a substantial role of DMOG-mediated CTGF induction for angiogenesis was obtained in an in vitro spheroid model of sprouting angiogenesis and provides a basis for further functional studies in the future.Unter Hypoxie wird der Transkriptionsfaktor hypoxia inducible factor (HIF)-1a stabilisiert und dieser induziert die Transkription einer Anzahl von Genen, die unterschiedliche biologische Prozesse einschließlich Erythropoiese und Angiogenese fördern. Die Angiogenese ist von entscheidender Bedeutung für die Wundheilung, aber auch für die Pathogenese und Progression von Erkrankungen wie z.B. diabetische Retinopathie, Psoriasis und Tumorerkrankungen. Da connective tissue growth factor (CTGF) durch die Interaktion mit Integrinen, Wachstumsfaktoren und Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) die einzelnen Phasen der Angiogenese beeinflussen kann, ist die Regulation von CTGF durch Hypoxie von besonderem Interesse. Über die hypoxische Regulation von CTGF ist wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Signalwege untersucht, die die CTGF Expression unter hypoxischen Bedingungen in Endothelzellen regulieren. Im Vordergrund stand die Analyse von Transkriptionsfaktoren der FoxO Familie, FoxO1 und FoxO3a. Weiterhin wurden PI3K/AKT, MAPK, RhoA/ROCK und Smad Signalwege untersucht. Erniedrigte Sauerstoffkonzentrationen oder Behandlung mit dem Prolylhydroxylaseinhibitor dimethyloxalylglycine (DMOG) führte zur Stabilisierung von HIF-1a und zur Hochregulation von CTGF in humanen makrovaskulären Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVEC) und in einer murinen mikrovaskulären Endothelzelllinie (glEND.2). Die Induktion von CTGF korrelierte mit der HIF-1a-abhängigen Erhöhung der Protein- und mRNA Level sowie der nukleären Akkumulation des Transkriptionsfaktors FoxO3a, während Expression und subzelluläre Lokalisation von FoxO1 nicht wesentlich beeinflusst wurde. Die Expression von CTGF wurde bei der Anwendung spezifischer siRNA gegen FoxO1 und/oder FoxO3a stark reduziert. Außerdem führte die Ausschleusung von FoxO Proteinen aus dem Kern bei Inhibition von Serin/Threonin-spezifischen Proteinphosphatasen durch Okadasäure zur Inhibition der Expression von CTGF. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass beide FoxO Proteine eine wichtige Rolle in der Regulation der CTGF Expression spielen. Die Beteiligung von FoxO1/3a an der CTGF Expression in Endothelzellen zeigte sich auch unter normoxischen Bedingungen, wenn der PI3K/AKT Signalweg inhibiert wurde. Inkubation von Endothelzellen mit LY294002, einem Inhibitor der PI3K, führte zur Akkumulation von FoxO1/3a im Kern und als Folge zur Induktion von CTGF. Dieser induktive Effekt wurde durch FoxO1/3a siRNA stark reduziert. Während sich der PI3K/AKT/FoxO Signalweg für die Regulation der CTGF Expression in Endothelzellen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen als essentiell erwiesen hat, waren die MAPK und RhoA/ROCK Signalwege an der DMOG-induzierten CTGF Expression nur partiell beteiligt. TGF-b1 induzierte die CTGF Expression durch Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3, während nur Smad2 für die DMOG-induzierte Regulation von CTGF von Bedeutung war. Die DMOG-induzierte CTGF Expression wurde bei Koinkubation mit TGF-b1 weiter erhöht. Dies deutet auf eine Kooperation zwischen unterschiedlichen Signalwegen in Endothelzellen hin. Die funktionelle Bedeutung von CTGF für die Angiogenese wurde in einem dreidimensionalen Sphäroidmodell untersucht, in dem die Aussprossung von Endothelzellen in Kollagengelen untersucht wurde. Bei Behandlung mit DMOG lösten sich Endothelzellen aus dem Sphäroid und bildeten Aussprossungen, sog. Sprouting. Knockdown von CTGF mittels siRNA führte zur starken Reduktion des Sproutings, was auf eine wichtige Rolle von CTGF für diesen Aspekt der Angiogenese hinweist. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass die Hypoxie- oder DMOG-stimulierte Expression und nukleäre Akkumulation von FoxO3a zusammen mit den Transkriptionsfaktoren FoxO1 und Smad2 für die Induktion von CTGF unter hypoxischen Bedingungen in Endothelzellen erforderlich sind. Ein erster Hinweis auf die funktionelle Bedeutung von CTGF für die Angiogenese ergab sich im Sprouting-Modell und muss in Zukunft durch weitere funktionelle Untersuchungen ergänzt werden

Cell type-specific regulation of CCN2 protein expression by PI3K–AKT–FoxO signaling

The biological activity of connective tissue growth factor (CTGF, CCN2) is regulated at the level of intracellular signaling leading to gene expression, and by its extracellular interaction partners which determine the functional outcome of CCN2 action. In this overview, we summarize the data which provide evidence that one of the major signaling pathways, phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)–AKT signaling, shows a remarkable cell type-dependence in terms of regulation of CCN2 expression. In smooth muscle cells, fibroblasts, and epithelial cells, inhibition of this pathway either reduced CCN2 expression or was not involved in CCN2 gene expression depending on the stimulus used. In microvascular endothelial cells by contrast, activation of PI3K–AKT signaling was inversely related to CCN2 expression. Upregulation of CCN2 upon inhibition of PI3K–AKT was also observed in primary cultures of human endothelial cells (HUVEC) exposed to laminar flow in an in vitro flow-through system. In different types of endothelial cells, FoxO transcription factors, which are negatively regulated by AKT, were identified as potent activators of CCN2 gene expression. In HUVEC, we observed a correlation between enhanced nuclear localization of FoxO1 and increased synthesis of CCN2 protein in areas of non-uniform shear stress. These data indicate that FoxO proteins are key regulators of CCN2 gene expression which determine the effect of PI3K–AKT activation in terms of CCN2 regulation. Short summary Phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)–AKT signaling shows a remarkable cell type-dependence in terms of regulation of CCN2 expression. In endothelial cells activation of PI3K - AKT signaling was inversely related to CCN2 expression. FoxO transcription factors, which are negatively regulated by AKT, were identified as potent activators of CCN2 gene expression

Regulation of CTGF Expression by Hypoxia in Endothelial Cells

Unter Hypoxie wird der Transkriptionsfaktor hypoxia inducible factor (HIF)-1a stabilisiert und dieser induziert die Transkription einer Anzahl von Genen, die unterschiedliche biologische Prozesse einschließlich Erythropoiese und Angiogenese fördern. Die Angiogenese ist von entscheidender Bedeutung für die Wundheilung, aber auch für die Pathogenese und Progression von Erkrankungen wie z.B. diabetische Retinopathie, Psoriasis und Tumorerkrankungen. Da connective tissue growth factor (CTGF) durch die Interaktion mit Integrinen, Wachstumsfaktoren und Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) die einzelnen Phasen der Angiogenese beeinflussen kann, ist die Regulation von CTGF durch Hypoxie von besonderem Interesse. Über die hypoxische Regulation von CTGF ist wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Signalwege untersucht, die die CTGF Expression unter hypoxischen Bedingungen in Endothelzellen regulieren. Im Vordergrund stand die Analyse von Transkriptionsfaktoren der FoxO Familie, FoxO1 und FoxO3a. Weiterhin wurden PI3K/AKT, MAPK, RhoA/ROCK und Smad Signalwege untersucht. Erniedrigte Sauerstoffkonzentrationen oder Behandlung mit dem Prolylhydroxylaseinhibitor dimethyloxalylglycine (DMOG) führte zur Stabilisierung von HIF-1a und zur Hochregulation von CTGF in humanen makrovaskulären Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVEC) und in einer murinen mikrovaskulären Endothelzelllinie (glEND.2). Die Induktion von CTGF korrelierte mit der HIF-1a-abhängigen Erhöhung der Protein- und mRNA Level sowie der nukleären Akkumulation des Transkriptionsfaktors FoxO3a, während Expression und subzelluläre Lokalisation von FoxO1 nicht wesentlich beeinflusst wurde. Die Expression von CTGF wurde bei der Anwendung spezifischer siRNA gegen FoxO1 und/oder FoxO3a stark reduziert. Außerdem führte die Ausschleusung von FoxO Proteinen aus dem Kern bei Inhibition von Serin/Threonin-spezifischen Proteinphosphatasen durch Okadasäure zur Inhibition der Expression von CTGF. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass beide FoxO Proteine eine wichtige Rolle in der Regulation der CTGF Expression spielen. Die Beteiligung von FoxO1/3a an der CTGF Expression in Endothelzellen zeigte sich auch unter normoxischen Bedingungen, wenn der PI3K/AKT Signalweg inhibiert wurde. Inkubation von Endothelzellen mit LY294002, einem Inhibitor der PI3K, führte zur Akkumulation von FoxO1/3a im Kern und als Folge zur Induktion von CTGF. Dieser induktive Effekt wurde durch FoxO1/3a siRNA stark reduziert. Während sich der PI3K/AKT/FoxO Signalweg für die Regulation der CTGF Expression in Endothelzellen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen als essentiell erwiesen hat, waren die MAPK und RhoA/ROCK Signalwege an der DMOG-induzierten CTGF Expression nur partiell beteiligt. TGF-b1 induzierte die CTGF Expression durch Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3, während nur Smad2 für die DMOG-induzierte Regulation von CTGF von Bedeutung war. Die DMOG-induzierte CTGF Expression wurde bei Koinkubation mit TGF-b1 weiter erhöht. Dies deutet auf eine Kooperation zwischen unterschiedlichen Signalwegen in Endothelzellen hin. Die funktionelle Bedeutung von CTGF für die Angiogenese wurde in einem dreidimensionalen Sphäroidmodell untersucht, in dem die Aussprossung von Endothelzellen in Kollagengelen untersucht wurde. Bei Behandlung mit DMOG lösten sich Endothelzellen aus dem Sphäroid und bildeten Aussprossungen, sog. Sprouting. Knockdown von CTGF mittels siRNA führte zur starken Reduktion des Sproutings, was auf eine wichtige Rolle von CTGF für diesen Aspekt der Angiogenese hinweist. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass die Hypoxie- oder DMOG-stimulierte Expression und nukleäre Akkumulation von FoxO3a zusammen mit den Transkriptionsfaktoren FoxO1 und Smad2 für die Induktion von CTGF unter hypoxischen Bedingungen in Endothelzellen erforderlich sind. Ein erster Hinweis auf die funktionelle Bedeutung von CTGF für die Angiogenese ergab sich im Sprouting-Modell und muss in Zukunft durch weitere funktionelle Untersuchungen ergänzt werden.Hypoxia leads to stabilisation of hypoxia inducible factor (HIF)-1a, which induces a number of genes involved in different biological processes including erythropoiesis and angiogenesis. Angiogenesis is essential in wound healing and in numerous pathologies e.g. diabetic retinopathy, psoriasis, and tumour growth. Connective tissue growth factor (CTGF) modulates different steps of angiogenesis via the interaction with growth factors, integrins and extracellular matrix components, but its regulation by hypoxia is poorly understood. Therefore, the aim of the present study was to investigate the signalling pathways involved in the regulation of CTGF by hypoxia in endothelial cells. This study focused on the analyses of transcripion factors of FoxO family, namely, FoxO1 and FoxO3a. Furthermore the PI3K/AKT, MAPK, RhoA/ROCK and Smad signalling pathways were investigated. Exposure to low oxygen tension or treatment with the hypoxia-mimetic dimethyloxalyl glycine (DMOG) stabilized HIF-1a and upregulated CTGF in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and in a murine microvascular endothelial cell line (glEND.2). Induction of CTGF correlated with a HIF-dependent increase in protein and mRNA levels, and nuclear accumulation of the transcription factor FoxO3a. By contrast, gene expression of FoxO1 was not significantly altered by hypoxia. Expression of CTGF was strongly reduced by siRNA silencing of FoxO1 or FoxO3a. Furthermore, nuclear exclusion of FoxO1/3a transcription factors by inhibition of serine/threonine protein phosphatases by okadaic acid inhibited CTGF expression, providing evidence that both FoxO proteins are regulators of CTGF expression. Involvement of FoxO1/3a in the regulation of CTGF expression was also observed in endothelial cells cultured unter normoxic conditions upon inhibition of PI3K/AKT signalling. Exposure of endothelial cells to LY294002, an inhibitor of PI3K, led to nuclear accumulation of FoxO1/3a and as a result to induction of CTGF. This inductive effect was strongly inhibited by FoxO1/3a siRNA. While PI3K/AKT signalling was essential for the regulation of CTGF expression in endothelial cells unter both normoxic and hypoxic conditions, MAPK and RhoA/ROCK signalling pathways were only partially involved in DMOG-inducible CTGF expression. TGF-b1 induced the expression of CTGF via activation of both Smad2 and Smad3 transcription factors, whereas only Smad2 was important for the DMOG-induced CTGF expression. The DMOG-induced CTGF expression was further increased when endothelial cells were co-incubated with TGF-b1, indicating cooperation between different signalling pathways. The relevance of DMOG-mediated CTGF induction for angiogenesis was investigated using an in vitro three dimensional spheroid model of sprouting angiogenesis. Endothelial cells embedded as spheroids in collagen gels formed capillary-like structures (sproutings) upon treatment with DMOG. DMOG-mediated sproutformation was strongly reduced by downregulation of CTGF using siRNA. This indicates that CTGF is essential for DMOG-induced sprouting angiogenesis. In summary, the data of the present study showed that hypoxia- or DMOG-stimulated expression and nuclear accumulation of FoxO3a, as well as transcription factors FoxO1 and Smad2 are required for induction of CTGF in endothelial cells under hypoxic conditions. First evidence of a substantial role of DMOG-mediated CTGF induction for angiogenesis was obtained in an in vitro spheroid model of sprouting angiogenesis and provides a basis for further functional studies in the future

Overexpression of far upstream element (FUSE) binding protein (FBP)-interacting repressor (FIR) supports growth of hepatocellular carcinoma

The far upstream element binding protein (FBP) and the FBP-interacting repressor (FIR) represent molecular tools for transcriptional fine tuning of target genes. Strong overexpression of FBP in human hepatocellular carcinoma (HCC) supports tumor growth and correlates with poor patient prognosis. However, the role of the transcriptional repressor FIR in hepatocarcinogenesis remains poorly delineated. We show that overexpression of FIR correlates with tumor dedifferentiation and tumor cell proliferation in about 60% of primary HCCs. Elevated FIR levels are associated with genomic gains of the FIR gene locus at chromosome 8q24.3 in human HCC specimens. In vitro, nuclear enrichment of FIR supports HCC cell proliferation and migration. Expression profiling of HCC cells after small interfering RNA (siRNA)-mediated silencing of FIR identified the transcription factor DP-1 (TFDP1) as a transcriptional target of FIR. Surprisingly, FIR stimulates the expression of FBP in a TFDP1/E2F1-dependent manner. FIR splice variants lacking or containing exon 2 and/or exon 5 are expressed in the majority of HCCs but not in normal hepatocytes. Specific inhibition of FIR isoforms with and without exon 2 revealed that both groups of FIR splice variants facilitate tumor-supporting effects. This finding was confirmed in xenograft transplantation experiments with lentiviral-infected short hairpin RNA (shRNA) targeting all FIR variants as well as FIR with and without exon 2. CONCLUSION: High-level nuclear FIR does not facilitate repressor properties but supports tumor growth in HCC cells. Thus, the pharmacological inhibition of FIR might represent a promising therapeutic strategy for HCC patients with elevated FIR expression

PI3K/AKT/mTOR‐dependent stabilization of oncogenic far‐upstream element binding proteins in hepatocellular carcinoma cells

UnlabelledTranscription factors of the far-upstream element-binding protein (FBP) family represent cellular pathway hubs, and their overexpression in liver cancer (hepatocellular carcinoma [HCC]) stimulates tumor cell proliferation and correlates with poor prognosis. Here we determine the mode of oncogenic FBP overexpression in HCC cells. Using perturbation approaches (kinase inhibitors, small interfering RNAs) and a novel system for rapalog-dependent activation of AKT isoforms, we demonstrate that activity of the phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase/AKT pathway is involved in the enrichment of nuclear FBP1 and FBP2 in liver cancer cells. In human HCC tissues, phospho-AKT significantly correlates with nuclear FBP1/2 accumulation and expression of the proliferation marker KI67. Mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition or blockade of its downstream effector eukaryotic translation initiation factor 4E activity equally reduced FBP1/2 concentrations. The mTORC1 inhibitor rapamycin diminishes FBP enrichment in liver tumors after hydrodynamic gene delivery of AKT plasmids. In addition, the multikinase inhibitor sorafenib significantly reduces FBP levels in HCC cells and in multidrug resistance 2-deficient mice that develop HCC due to severe inflammation. Both FBP1/2 messenger RNAs are highly stable, with FBP2 being more stable than FBP1. Importantly, inhibition of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase/AKT/mTOR signaling significantly diminishes FBP1/2 protein stability in a caspase-3/-7-dependent manner.ConclusionThese data provide insight into a transcription-independent mechanism of FBP protein enrichment in liver cancer; further studies will have to show whether this previously unknown interaction between phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase/AKT/mTOR pathway activity and caspase-mediated FBP stabilization allows the establishment of interventional strategies in FBP-positive HCCs

Flour - Bread '19 : Proceedings of the 10th International Congress Flour - Bread '19 and 12th Croatian Congress of Cereal Technologists Brašno - Kruh '19

Proceedings contains 3 Reviews, 8 Original research articles and 3 Professional articles presented at 10th International Congress Flour – Bread ’19 and 12th Croatian Congress of Cereal Technologists Brašno – Kruh ’1