Rozległa delecja w genie KAL1 u dwóch spokrewnionych pacjentów z hipogonadyzmem hipogonadotropowym: użyteczność diagnostyczna technik cytogenetycznych i molekularnych

Background: Kallmann syndrome type 1 (KS1) is a heterogeneous disorder where hypogonadotropic hypogonadism (HH) associated with an impaired sense of smell is observed. The aim of this study was to investigate the usefulness of the multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) technique for differential diagnosis in comparison with molecular cytogenetics — fluorescence in situ hybridisation (FISH) or traditional PCR analysis and propose a diagnostic approach for patients with KS. Material and methods: Karyotype and PCR analysis in two related patients and other family members were performed, followed by MLPA dosage sensitive analysis. Results: In the proband and his maternal uncle, the PCR allowed the detection of a large deletion within the KAL1 gene, from exon 4 to 14 (c.469-?_6314+?del). The deletion was also diagnosed in three female carriers in the presented family. These results were proved by the MLPA technique. Moreover, we traced the presence of the region located downstream and upstream to the KAL1 gene on Xq22.32. However, FISH analysis failed to reveal any deletion in the critical region for KS. Simultaneously, we report difficulties connected with the PCR technique based on the primers for KAL1 amplification presented in the literature. We designed primers that are specific to the X chromosome and bypass pseudogene KALY amplification. Conclusions: FISH analysis is a convenient screening technique, but in the presented family it failed to detect the deletion. Therefore, in the face of a distinctive manifestation of KS, a subsequent molecular assay should be introduced. The MLPA is a useful technique for differential diagnosis in patients with HH combined with smell impairment. (Pol J Endocrinol 2011; 62 (3): 224–229)Wstęp: Zespół Kallmanna typu 1 (ZK1) jest zaburzeniem heterogennym, w którym cechy hipogonadyzmu hipogonadotropowego mogą współistnieć z upośledzeniem węchu. Choroba ta może występować sporadycznie lub rodzinnie. Celem pracy była ocena użyteczności metody amplifikacji multipleks zależnej od ligacji sond (MLPA) w porównaniu z technikami cytogenetyki molekularnej i PCR w diagnostyce różnicowej ZK oraz zaproponowanie schematu postępowania diagnostycznego w jego przypadkach. Wczesne rozpoznanie ZK umożliwia leczenie objawowe z korzystnym efektem dla rozwoju cech płciowych i płodności u części chorych. Materiał i metody: Badania przeprowadzono u 2 spokrewnionych chorych i członków ich rodziny. Oceniano kariotyp za pomocą technik cytogenetyki klasycznej i molekularnej — fluoroscencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). W badaniach DNA wykorzystano PCR, a następnie MLPA pod kątem jego analizy jakościowej i ilościowej. Wyniki: U probanta i jego wuja za pomocą PCR wykryto delecję obejmującą eksony od 4 do 14 (c.469-?_6314+?del) genu KAL1. U trzech kobiet z rodziny pacjentów stwierdzono nosicielstwo tej delecji. Nie uwidoczniono jej za pomocą FISH z sondą specyficzną dla regionu krytycznego obejmującego KAL1. Obecność delecji potwierdzono, stosując MLPA. Udokumentowano jednocześnie obecność sekwencji położonych poniżej i powyżej genu KAL1 na wysokości prążka Xq22.32. W pracy zilustrowano również trudności związane z amplifikacją KAL1 przy zastosowaniu starterów opisanych w literaturze. Zaprojektowano własne sekwencje starterów, wykluczające jednoczesną amplifikację pseudogenu KALY. Wnioski: Metoda FISH jest dogodną techniką przesiewową w diagnostyce mikrodelecji, jednak w przypadku prezentowanej w pracy rodzinie nie pozwoliła na wykrycie delecji wewnątrzgenowej. U chorych z objawami odpowiadającymi ZK należy zatem w podobnych przypadkach zastosować inne metody analizy molekularnej. Potwierdzono użyteczność techniki MLPA w diagnostyce różnicowej pacjentów z HH i zaburzeniami węchu. (Endokrynol Pol 2011; 62 (3): 224–229

Rodzinna częściowa lipodystrofia w diagnostyce różnicowej zespołu policystycznych jajników

  According to current diagnostic criteria, polycystic ovary syndrome (PCOS) is effective as a diagnosis of exclusion. Here, we present a case of a 31-year-old woman with a history of oligomenorrhoea and hirsutism, who, despite a “muscular” appearance and a normal body mass index (22.27 kg/m2), was found to have an extreme insulin resistance and diabetes accompanied by hyperandrogenism and polycystic ovaries. An autoimmune screen for possible latent autoimmune diabetes in adults was negative. She was subsequently found to have familial partial lipodystrophy (FPLD2, OMIM #151660) caused by an R482Q mutation in the LMNA gene encoding lamin A/C. This mutation results in arginine to glutamine substitution at the protein level, while phenotypically this condition presents with a loss of body fat, insulin resistance, dyslipidaemia, and other features mimicking PCOS. Interestingly her mother, with a history of myocardial infarction and diabetes at the age of 46 but no oligomenorrhoea, was also found to harbour the same mutation (LMNA R482Q). Conclusions: Our case highlights the importance of assessment of adipose tissue distribution, as well as a significance of assessment of glucose tolerance and insulin resistance in the differential diagnosis of PCOS. Furthermore, patients with atypical adipose tissue distribution should be referred for formal genetic testing. (Endokrynol Pol 2015; 66 (6): 550–554)    Według aktualnych kryteriów diagnostycznych, zespół policystycznych jajników (PCOS) jest rozpoznaniem z wykluczenia. W pracy przedstawiono przypadek 31-letniej kobiety z wywiadem zaburzeń miesiączkowania o typie rzadkich miesiączek oraz hirsutyzmu, u której mimo „muskularnego” wyglądu i prawidłowego wskaźnika masy ciała (22,27 kg/m2) stwierdzono bardzo wysoką insulinooporność, cukrzycę i hiperandrogenizm ze współistniejącą morfologią policystycystyczną jajników. Badania autoimmunologiczne w kierunku możliwej autoimmunologicznej cukrzycy u dorosłych (tzw. LADA) były ujemne. Przeprowadzono diagnostykę genetyczną, rozpoznając rodzinną lipodystrofię częściową spowodowaną przez mutację laminy A/C genu R842Q (FPLD2, OMIM # 151660). Powyższa mutacja prowadzi do podstawienia argininy glutaminą (R482Q) na poziomie białka, natomiast fenotypowo objawia się utratą tkanki tłuszczowej, insulinoopornością, dyslipidemią, jak również cechami naśladującymi PCOS. Co ciekawe u matki pacjentki również rozpoznano tę samą mutację (lamina A/C genu R842Q). U matki wystąpił również zawał serca i cukrzyca w wieku 46 lat, jednak nie było u niej zaburzeń miesiączkowania o typie oligomenorrhoea. Wnioski: Opisany przypadek podkreśla znaczenie oceny dystrybucji tkanki tłuszczowej, jak również znaczenie oceny tolerancji glukozy i insulinooporności w diagnostyce różnicowej PCOS. Autorzy pracy zalecają również, aby pacjentki z nietypowym rozkładem tkanki tłuszczowej były kierowane do dalszej diagnostyki genetycznej. (Endokrynol Pol 2015; 66 (6): 550–554)

Association between idiopathic recurrent pregnancy loss and genetic polymorphisms in cytokine and matrix metalloproteinase genes

Objectives: Recurrent reproductive loss (RPL) is a global health issue affecting a significant number of women. Approximately half of miscarriages have an unexplained etiology. Familial aggregation and twins studies prove that some cases of the RPL could have a genetic background. Recent evidences suggest that cytokines (e.g. IL-6, TNF alpha or TGF beta) and matrix metalloproteinases (MMP) are important for maintenance of pregnancy. Single gene polymorphisms (SNP), affecting these proteins production or their function may predispose to the loss of the pregnancy. The aim of this study was to evaluate the association between the following polymorphisms of IL6 (rs1800795), TNF (rs1800629), TGFB1 (rs1800471), MMP1 (rs1799750), MMP2 (rs2285053 and rs243865), MMP3 (rs35068180), MMP9 (rs3918242) and the recurrent pregnancy loss in polish population.Material and methods: Study subjects comprised of 67 patients with a history of recurrent pregnancy loss (≥ 2 miscarriages in history) and 75 controls. The distribution of genotypes for selected polymorphisms were determined by RFLP-PCR.Results: Maternal genotypes GG TNF, or 5A/5A MMP3 may be associated with the recurrent pregnancy loss. No association between the IL6, TGFB1, MMP1, MMP2, or MMP9 studied polymorphisms and the predisposition to miscarriage was found.Conclusions: This study demonstrated a possible association between rs1800629 TNF, rs35068180 MMP3 polymorphisms and recurrent pregnancy loss

The risk of neoplasm associated with dysgenetic testes in prepubertal and pubertal/adult patients

Introduction. In patients with Y-chromosome in the karyotype, partial gonadal dysgenesis and disorders of male reproductive sex organs development are usually resected in childhood because of the high risk of germ cell tumours (GCT). In patients with Y-chromosome, complete gonadal dysgenesis and female genitalia gonadectomy is performed markedly later. However, due to the relatively low number of adult patients with preserved dysgenetic gonads, the true risk of neoplasm is unknown. The aim of the study was to evaluate the prevalence of neoplasia in dysgenetic gonads of children and adults with Y-chromosome in a retrospective study. Material and methods. A review of medical documentation of 94 patients with disorders of sex development (DSD), Y-chromosome and gonadal dysgenesis (GD), aged 1.2–32 years (47 prepubertal, 1.2–10 years; 47 pubertal/adult, 13–32 years), was conducted. Serum levels of follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and testosterone were determined. Bilateral gonadectomy was performed in 73.4% of patients, and unilateral gonadectomy with biopsy of the contralateral gonad in 26.4%. All gonadal tissues were subjected to immunohistochemical evaluation with antibodies against PLAP and OCT3/4 (markers of malignant germ cells, but also foetal multipotent germ cells), while gonads of prepubertal patients were examined by c-KIT, as well. Results. Streak gonads were identified on both sides (complete GD) in 30.8%, a streak gonad on one side and an underdeveloped testis on the other (asymmetric GD) in 38.3%, and underdeveloped testicular structure on both sides (partial GD) in 30.8% of cases. Germ cell neoplasia was found in 53.2% of patients (51.1% in children, 55.3% in pubertal/adults). Invasive GCT were identified in 11.7% of cases, of which 90.9% were in pubertal/adult patients. Other neoplastic lesions included gonadoblastoma (16% prevalence) and testicular carcinoma in situ (25.5%). In younger patients FSH serum levels were increased in 81% of cases (mean 2.82 ± 2.18 IU/L), while LH in 58% (mean 1.82 ± 1.69 IU/L). Hypergonadotropic hypogonadism was diagnosed in most of the pubertal/ /adult patients (mean FSH 54.2 ± 23.3 IU/L, mean LH 21.7 ± 12.1 IU/L, mean testosterone 5.5 ± 4.5 nmol/L). Conclusions. Dysgenetic gonads in patients with Y chromosome have a high risk of germ cell neoplasia (ca. 50%). If they are preserved until puberty/early adulthood, they may develop overt, invasive GCT. The gonads also have poor hormonal activity (hypergonadotropic hypogonadism) in most of the pubertal/adult patients. Each of these cases must be considered individually and a decision to remove the gonad or not should be based on the comprehensive analysis of the phenotype by a multidisciplinary team of specialists in consultation with the patient and the parents. If dysgenetic gonads are not resected in childhood, these patients need careful ongoing follow-up examination, including biopsy and histopathological evaluation.

Diaphragmatic hernia in Reference Hospital ICZMP – diagnostic problems and outcome

Objectives: The aim of the study was to analyze US/ECHO examinations in fetuses with diaphragmatic hernia (DH) diagnosed and treated in our institution from 1994-2006, and their follow-up. Material and methods: Retrospective analysis of the data base from Department for Diagnoses & Prevention of Fetal Malformations, Research Institute of the Polish Mother’s Memorial Hospital: 14 481 fetal echo/ultrasound examinations in 10 077 fetuses have been analyzed to retrieve 115 fetuses with DH. Results: The mean gestational age at the targeted US/ECHO examination was 30 wks. There were 8 terminations of pregnancies (at mean 21 wks), 6 intrauterine demises, 60 neonatal deaths after delivery (in 1-3rd day of postnatal life), 8 deaths after surgery, 19 neonates were discharged home and in 14 cases the follow-up could not be monitored. The most common anomalies accompanying DH have been central nervous system anomalies (20%), polyhydramnion (16%) and cong heart defects (10%). In this subgroup, there was 100% mortality. Isolated DH has been diagnosed in every third case. In this subgroup, 27 neonates had undergone surgery and the survival rate was 70%, however since 2004 there was not a single death on record. Conclusions: Late gestational age of US/ECHO examinations in our tertiary center suggests that DH has been relatively difficult to detect during ultrasound screening. DH and the other structural malformations have been a lethal disease in our series in 100%. Isolated DH was much less frequent and was present in every third case (29%), and in this group the survival rate was 70%, regardless of the way of the delivery (CS or Vaginal)

Novel synonymous and missense variants in FGFR1 causing Hartsfield syndrome

Hartsfield syndrome is a rare clinical entity characterized by holoprosencephaly and ectrodactyly with the variable feature of cleft lip/palate. In addition to these symptoms patients with Hartsfield syndrome can show developmental delay of variable severity, isolated hypogonadotropic hypogonadism, central diabetes insipidus, vertebral anomalies, eye anomalies, and cardiac malformations. Pathogenic variants in FGFR1 have been described to cause phenotypically different FGFR1-related disorders such as Hartsfield syndrome, hypogonadotropic hypogonadism with or without anosmia, Jackson–Weiss syndrome, osteoglophonic dysplasia, Pfeiffer syndrome, and trigonocephaly Type 1. Here, we report three patients with Hartsfield syndrome from two unrelated families. Exome sequencing revealed two siblings harboring a novel de novo heterozygous synonymous variant c.1029G>A, p.Ala343Ala causing a cryptic splice donor site in exon 8 of FGFR1 likely due to gonadal mosaicism in one parent. The third case was a sporadic patient with a novel de novo heterozygous missense variant c.1868A>G, p.(Asp623Gly)

Genetic aspects of plycystic ovary syndrome

Zespół policystycznych jajników (PCOS – polycystic ovary syndrome) należy do często występujących heterogennych zaburzeń w zakresie układu dokrewnego objawiających się brakiem miesiączki (lub skąpym miesiączkowaniem), podwyższonym poziomem androgenów surowicy krwi, hirsutyzmem, otyłością, opornością na insulinę i około 7-krotnie wyższym od przeciętnego ryzykiem rozwoju cukrzycy typu 2, insulinoniezależnej (NIDDM - non-insulin dependent diabetes mellitus). Jest jedną z wiodących przyczyn niepłodności u kobiet. Częstość występowania PCOS u kobiet w wieku rozrodczym określana jest w przedziale 3-12%. Opisano rodzinne występowanie zespołu. Stwierdzono także różnice etniczne i rasowe w częstości występowania zespołu jak i poszczególnych jego objawów. Patogeneza PCOS obejmuje zmiany w różnych szlakach metabolicznych. Analizowanych jest szereg genów odpowiedzialnych za przebieg poszczególnych etapów biosyntezy i metabolizmu hormonów steroidowych (StAR, CYP11, CYP17, CYP19 HSD17B1-3, HSD3B1-2), za działanie gonadotropin i hormonów wydzielanych przez gonady (ACTR1, ACTR2A-B, FS, INHA, INHBA-B, INHC, SHBG, LHCGR, FSHR, MADH4, AR), za otyłość i regulację procesów energetycznych (MC4R, OB, OBR, POMC, UCP2-3), za wydzielanie insuliny i jej działanie (IGF1, IGF1R, IGFBPI1-3, INS VNTR, INSR, INSL, IRS1-2, PPARG) oraz szereg innych. Większość kobiet z zespołem policystycznych jajników, zarówno otyłych jak i szczupłych wykazuje różny stopień oporności na insulinę. Minisatelitarny DNA w obrębie genu dla insuliny (INS VNTR), a szczególnie allele typu III lub genotypy III/III, mogą nie tylko determinować predyspozycję do wystąpienia bezowulacyjnego PCOS lecz mogą być także współodpowiedzialne za wystąpienie cukrzycy typu 2. Czynność receptora insulinowego (INSR) jest prawdopodobnie prawidłowa u kobiet z PCOS. Jednakże występująca w jego obrębie nieprawidłowa fosforylacja seryny może prowadzić do zakłóceń na szlaku przekazywania sygnału już po związaniu insuliny z receptorem. Proces fosforylacji seryny odgrywa również rolę w posttranslacyjnej regulacji aktywności 17,20-liazy (CYP17). Może to przemawiać za wspólną patogenezą oporności na insulinę oraz hiperandrogenizmu. Polimorficzność alleli genów IRS-1 i IRS-2 (insulin receptor substrate 1 i 2) oddzielnie lub we wzajemnych kombinacjach, także może mieć swój udział w powstawaniu insulinooporności w PCOS. Nie potwierdzono natomiast potencjalnego związku między tym objawem a polimorfizmami w obrębie genu dla follistatyny. Wydaje się, że PCOS może wykazywać związek z allelami charakteryzującymi się brakiem krótkich, czterokrotnych powtórzeń pięcionukleotydowego motywu (TTTTA)n w obrębie genu CYP11A kodującego powstanie cytochromu P450scc. Zakłada się hipotetycznie, że wzmożona aktywność tego enzymu może przyczyniać się do wzrostu produkcji androgenów. Nie dostarczono natomiast żadnych dowodów na istnienie związku między objawami PCOS, a zmianami w obrębie genu CYP19, kodującego cytochrom P450arom. Związek taki istnieje za to między polimorfizmem genu receptora androgenowego (AR), a działaniem androgenów w PCOS. Stwierdzono także, że hirsutyzm u kobiet z PCOS i prawidłowymi poziomami testosteronu, może zależeć od skrócenia sekwencji powtórzonych CAG w obrębie AR. Analizowano także zarówno ekspresję receptora estrogenowego (Ers) jak i aktywność 5α-reduktazy w komórkach ziarnistych (GC; granulosa cells) oraz tekalnych (TC; theca cells). Stwierdzono znaczące zmiany w ekspresji tak receptora ERα jak i ERβ w PCOS mogące mieć związek z nieprawidłowym rozwojem pęcherzyków jajnika. Z drugiej strony podwyższona aktywność genu SRD5A może przemawiać za udziałem androgenów poddanych działaniu 5α-reduktazy w patogenezie PCOS. Etiologia PCOS nadal pozostaje nie w pełni poznana. Ekspresja objawów zespołu zależy od związków między szeregiem czynników. Jest niemal nieprawdopodobne, aby udało się określić pojedynczy czynnik odpowiadający za wystąpienie zespołu. Poddano dyskusji inne potencjalne mechanizmy w patogenezie PCOS.Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common heterogenous endocrine disorder associated with amenorrhoea (or oligomenorrhoea), hyperandrogenism, hirsutism, obesity, insulin resistance, and an approximately 7-fold increased risk of type 2 diabetes mellitus (NIDDM – non-insulin dependent diabetes mellitus). It is a leading cause of female infertility. The prevalence of PCOS among reproductive-age women has been estimated at 4%-12%. Familial aggregation of this syndrome is well established. There are also ethnic and racial variations in the prevalence of the syndrome and its symptoms. Multiple biochemical pathways have been implicated in the pathogenesis of PCOS. Several genes from these pathways have been tested include genes involved in steroid hormone biosynthesis and metabolism (StAR, CYP11, CYP17, CYP19 HSD17B1-3, HSD3B1-2), gonadotropin and gonadal hormones action (ACTR1, ACTR2A-B, FS, INHA, INHBA-B, INHC, SHBG, LHCGR, FSHR, MADH4, AR), obesity and energy regulation (MC4R, OB, OBR, POMC, UCP2-3), insulin secretion and action (IGF1, IGF1R, IGFBPI1-3, INS VNTR, IR, INSL, IRS1-2, PPARG) and many others.Most women with PCOS, both obese and lean, have a degree of insulin resistance. The minisatellite of insulin gene (INS VNTR), especially class III alleles and III/III genotypes might not only determine the predisposition to anovulatory PCOS but also the concomitant risk for development of type 2 diabetes. The function of the insulin receptor (IR) is probably normal in woman with PCOS. However abnormal serine phosphorylation in the receptor may impair signal transduction accounting for a post-binding defect in insulin action. Serine phosphorylation is also involved in the postranslational regulation of 17,20-lyase activity (CYP17). There may be a common aetiology for both insulin resistance and hyperandrogenism. Polymorphic alleles of both IRS-1 and IRS-2 (insulin receptor substrate 1 – 2), alone or in combination, may have a functional impact on the insulin-resistant component of PCOS. There is no evidence to suggest that follistatin gene polymorphisms play a role in the pathogenesis of insulin resistance in PCOS women.PCOS appears to be associated with the absence of the four-repeat-units allele in a polymorphic region of penta-nucleotide (TTTTA)n repeats within CYP11A gene, which encodes cytochrome P450scc. It has been hypothesized that up-regulation of this enzyme could lead to increased androgen production. There is no evidence of any association of alleles of CYP19 gene (encoding cytochrome P450arom) with PCOS. Association exists between androgen receptor gene (AR) polymorphisms an androgens action in PCOS. Increased hirustism and decreased CAG repeat length within AR gene has been also demonstrated in women with normal testosterone levels.Expression of estrogen receptor (ERs) as well as 5-α-reeducates (SRD5A1-2 genes) activity was analysed in granulosa (GC) and theca cells (TC). The results of this study demonstrate that there are significant alterations in the expression of ERα and ERβ in PCOS that may be related to abnormal follicular development. On the other hand elevated SRD5A activity in polycystic ovaries supported the hypothesis that 5-α-reduced androgens may play a role in the pathogenesis of the syndrome. The genetic aetiology of PCOS remains unknown. There are a number of interlinking factors that affects expression of PCOS. Single cause of PCOS is unlikely. Other possible mechanisms in pathogenesis of PCOS are discussed

Influence of MRI contrast media on histamine release from mast cells

Background: Mast cells, owing to diversity of secreted mediators, play a crucial role in the regulation of inflammatory response. Together with basophils, mast cells constitute a central pathogenetic element of anaphylactic (IgE-dependent) and anaphylactoid (IgE-independent) reactions. In severe cases, generalized degranulation of mast cells may cause symptoms of anaphylactic shock. The influence of the classical, iodine-based contrast media on mastocyte degranulation has been fully described. Our objective was to determine the influence of the gadolinium-based MRI contrast media on histamine release from mast cells and to compare the activity of ionic and non-ionic preparations of contrast media. Material/Methods: To determine the intensity of mast cell degranulation, we used an experimental model based on mastocytes isolated from rat peritoneal fluid. Purified suspensions of mast cells were incubated with various concentrations of Gd-DTPA and Gd-DTPA-BMA, and solutions of PEG 600 which served as a non-toxic osmotic stimulus. The intensity of mast cell activation was presented as mean percentage of histamine released from cells after incubation. Results/Conclusions: The obtained results demonstrate that both ionic and non-ionic preparations of the MRI contrast media are able to induce mast cell degranulation in vitro. It was also proved that the non-ionic MRI contrast media stimulate mast cells markedly more weakly than ionic contrast media at identical concentration. The aforementioned results may suggest a more profitable safety profile of the nonionic contrast preparations. We may also conclude that triggering of mast cell degranulation after incubation with the solutions of MRI contrast media results from non-specific osmotic stimulation and direct toxicity of free ionic residues