The class V myosin motor protein, Myo2, plays a major role in mitochondrial motility in Saccharomyces cerevisiae

The actin cytoskeleton is essential for polarized, bud-directed movement of cellular membranes in Saccharomyces cerevisiae and thus ensures accurate inheritance of organelles during cell division. Also, mitochondrial distribution and inheritance depend on the actin cytoskeleton, though the precise molecular mechanisms are unknown. Here, we establish the class V myosin motor protein, Myo2, as an important mediator of mitochondrial motility in budding yeast. We found that mutants with abnormal expression levels of Myo2 or its associated light chain, Mlc1, exhibit aberrant mitochondrial morphology and loss of mitochondrial DNA. Specific mutations in the globular tail of Myo2 lead to aggregation of mitochondria in the mother cell. Isolated mitochondria lacking functional Myo2 are severely impaired in their capacity to bind to actin filaments in vitro. Time-resolved fluorescence microscopy revealed a block of bud-directed anterograde mitochondrial movement in cargo binding–defective myo2 mutant cells. We conclude that Myo2 plays an important and direct role for mitochondrial motility and inheritance in budding yeast

Einfluss der Johanniskrautinhaltsstoffe Hyperforin, Hyperosid und Hypericin auf die laterale Mobilität und die Signaltransduktion von 5-HT_1A-Rezeptoren

Johanniskrautextraktpräparate sind in Deutschland für die kurzzeitige Behandlung der Symptome leichter depressiver Störungen sowie für die Therapie von leichten bis mittelschweren Depressionen zugelassen. Die antidepressive Wirkung von Johanniskrautextraktpräparaten ist klinisch belegt, der zugrunde liegende Wirkungsmechanismus allerdings noch nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Johanniskrautinhaltsstoffe Hyperforin, Hyperosid und Hypericin auf die laterale Mobilität unbelegter sowie belegter 5-HT1A-Rezeptoren sowie deren Signaltransduktion untersucht werden. Die laterale Mobilität wurde sowohl mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie als auch Einzelmolekülverfolgung bestimmt. Um diese Untersuchungen zu ermöglichen, wurde ein SNAP-tag-Konstrukt des 5-HT1A-Rezeptors gentechnisch generiert und C6-Zellen damit stabil transfiziert. Dieses Konstrukt ermöglicht es, die 5-HT1A-ST-Rezeptoren bei Bedarf mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu koppeln. Darüber hinaus wurde der 5-HT1A-Rezeptor-Agonist 8-OH-DPAT chemisch so verändert, dass er einer Fluoreszenzmarkierung mit Alexa Fluor® 532- Carbonsäuresuccinimidylester zugänglich wurde. Mit Hilfe der stabil transfizierten C6-Zellen sowie des fluoreszenzmarkierten 5-HT1A-Rezeptoragonisten EL409-Alexa532, konnte die laterale Mobilität von fünf unbelegten Rezeptormobilitäten sowie zwei Rezeptor-Ligand-Komplex-Mobilitäten beschrieben werden. Im Anschluss daran wurde der Einfluss einer sechstägigen Vorbehandlung mit Hyperforin, Hyperosid und Hyperforin sowie den Vergleichssubstanzen Citalopram und Desipramin auf die laterale Mobilität der 5-HT1A-ST-Rezeptoren untersucht. Für die Vorbehandlung der Zellen mit Hyperforin, Hyperosid und Desipramin konnte eine Verlangsamung der unbelegten Rezeptormobilitäten, die sich einerseits in einem geringeren Diffusionskoeffizienten und andererseits in einer Verschiebung der Anteile hin zu weniger mobilen Rezeptormobilitäten äußerte, gefunden werden. Die Hypericinvorinkubation führte zu einem starken Anstieg der immobilen, unbelegten Rezeptorpopulation. Citalopram zeigte keinen Einfluss auf die unbelegten 5-HT1A-ST-Rezeptoren. Auf die laterale Mobilität der Rezeptor-Ligand-Komplexe konnte kein Einfluss der Testsubstanzen entdeckt werden. Eine Veränderung der lateralen Mobilität eines Rezeptors kann sich auf dessen Signaltransduktion auswirken. Daher wurde die Konzentration des mit dem 5-HT1A gekoppelten Second Messengers cAMP nach Vorbehandlung der Zellen mit den Johanniskrautinhaltsstoffen sowie den Vergleichssubstanzen untersucht. Es wurde der cAMP-Spiegel unstimulierter C6-5-HT1A-ST-Zellen sowie die cAMPSpiegel von mit Forskolin, 8-OH-DPAT oder simultan mit Forskolin und 8-OH-DPAT stimulierten Zellen quantifiziert. Die gefundene Veränderung der lateralen Mobilität pflanzte sich in einer veränderten Signaltransduktion der vorbehandelten Zellen fort. So konnte für Hyperforin, Hyperosid und Desipramin jeweils eine Hemmung der konstitutiven Aktivität der 5-HT1A-ST-Rezeptoren, die sich in einer verstärkten cAMPSynthese nach Stimulation mit Forskolin bemerkbar machte, gefunden werden. Der starke Anstieg des immobilen Rezeptoranteils nach Hypericinvorbehandlung ging mit einer verminderten Signaltransduktion des 5-HT1A-ST-Rezeptors einher. Dies machte sich in einer verminderten Differenz der cAMP-Spiegel zwischen Forskolin- und simultaner Forskolin- und 8-OH-DPAT-Stimulation bemerkbar. Die chromatischen Eigenschaften von Hypericin verhindern eine Auswertung der FCS-Untersuchungen. Die daher unvollständige Datenlage macht eine Einschätzung, ob Hypericin einen Beitrag über den 5-HT1A-Rezeptor zum antidepressiven Wirkungsmechanismus des Johanniskrautextraktes leistet, unmöglich. Die gefundene Hemmung der konstitutiven Aktivität des 5-HT1A-ST-Rezeptors durch Hyperforin und Hyperosid könnte in Fällen einer veränderten oder gestörten konstitutiven Aktivität des 5-HT1A-Rezeptors von Vorteil sein. Die gefundenen Ergebnisse stellen einen Beitrag zur Entschlüsselung des antidepressiven Wirkungsmechanismus von Johanniskraut dar

Two-color STED microscopy reveals different degrees of colocalization between hexokinase-I and the three human VDAC isoforms

The voltage-dependent anion channel (VDAC, also known as mitochondrial porin) is the major transport channel mediating the transport of metabolites, including ATP, across the mitochondrial outer membrane. Biochemical data demonstrate the binding of the cytosolic protein hexokinase-I to VDAC, facilitating the direct access of hexokinase-I to the transported ATP. In human cells, three hVDAC isoforms have been identified. However, little is known on the distribution of these isoforms within the outer membrane of mitochondria and to what extent they colocalize with hexokinase-I. In this study we show that whereas hVDAC1 and hVDAC2 are localized predominantly within the same distinct domains in the outer membrane, hVDAC3 is mostly uniformly distributed over the surface of the mitochondrion. We used two-color stimulated emission depletion (STED) microscopy enabling a lateral resolution of ~40 nm to determine the detailed sub-mitochondrial distribution of the three hVDAC isoforms and hexokinase-I. Individual hVDAC and hexokinase-I clusters could thus be resolved which were concealed in the confocal images. Quantitative colocalization analysis of two-color STED images demonstrates that within the attained resolution, hexokinase-I and hVDAC3 exhibit a higher degree of colocalization than hexokinase-I with either hVDAC1 or hVDAC2. Furthermore, a substantial fraction of the mitochondria-bound hexokinase-I pool does not colocalize with any of the three hVDAC isoforms, suggesting a more complex interplay of these proteins than previously anticipated. This study demonstrates that two-color STED microscopy in conjunction with quantitative colocalization analysis is a powerful tool to study the complex distribution of membrane proteins in organelles such as mitochondria

Symmetry breaking in the female germline cyst.

[Figure: see text]

Homogeneous Distribution of Polymerizable Coumarin Dyes for Active Few Mode POF

For most kinds of active polymer optical fibers, a homogeneous distribution of dye molecules over the entire fiber length and cross section is required. In this study, chemical bonding of dyes to poly(methyl methacrylate) (PMMA) by copolymerization is achieved within the polymerization process instead of dissolving the dyes in the monomers. In combination with an improved fabrication mechanism, this leads to homogeneous dye distribution within the preforms. A method for proving the integration of the dyes into the polymer chains has been developed using high-performance liquid chromatography (HPLC) and size exclusion chromatography (SEC). Prestructured core-cladding preforms with dye-doped poly(cylohexyl methacrylate-co-methyl methacrylate)-core have been prepared with the Teflon string technique and were heat-drawn to few mode fibers

Fluorescence Correlation Spectroscopy in Drug Discovery: Study of Alexa532-Endothelin 1 Binding to the Endothelin ETA Receptor to Describe the Pharmacological Profile of Natural Products

Fluorescence correlation spectroscopy and the newly synthesized Alexa532-ET1 were used to study the dynamics of the endothelin ETA receptor-ligand complex alone and under the influence of a semisynthetic selective antagonist and a fungal extract on living A10 cells. Dose-dependent increase of inositol phosphate production was seen for Alexa532-ET1, and its binding was reduced to 8% by the selective endothelin ETA antagonist BQ-123, confirming the specific binding of Alexa532-ET1 to the endothelin ETA receptor. Two different lateral mobilities of the receptor-ligand complexes within the cell membrane were found allowing the discrimination of different states for this complex. BQ-123 showed a strong binding affinity to the “inactive” receptor state characterized by the slow diffusion time constant. A similar effect was observed for the fungal extract, which completely displaced Alexa532-ET1 from its binding to the “inactive” receptor state. These findings suggest that both BQ-123 and the fungal extract act as inverse agonists

Localised dynactin protects growing microtubules to deliver oskar mRNA to the posterior cortex of the Drosophila oocyte.

The localisation of oskar mRNA to the posterior of the Drosophila oocyte defines where the abdomen and germ cells form in the embryo. Kinesin 1 transports oskar mRNA to the oocyte posterior along a polarised microtubule cytoskeleton that grows from non-centrosomal microtubule organising centres (ncMTOCs) along the anterior/lateral cortex. Here, we show that the formation of this polarised microtubule network also requires the posterior regulation of microtubule growth. A missense mutation in the dynactin Arp1 subunit causes most oskar mRNA to localise in the posterior cytoplasm rather than cortically. oskar mRNA transport and anchoring are normal in this mutant, but the microtubules fail to reach the posterior pole. Thus, dynactin acts as an anti-catastrophe factor that extends microtubule growth posteriorly. Kinesin 1 transports dynactin to the oocyte posterior, creating a positive feedback loop that increases the length and persistence of the posterior microtubules that deliver oskar mRNA to the cortex