Analyse der MACF1 Isoform-3 Funktionen, einem Spektraplakin Protein mit dualen Rollen im Zytoplasma und dem Nukleus

ZUSAMMENFASSUNG Das Spektraplakin Familienmitglied MACF1 (Microtubule Actin Cross-linking Factor 1) ist ein großes (620-800 kDa) Multidomänenprotein, welches Mikrofilamente und Mikrotubuli quervernetzt. Das MACF1 Gen kodiert für verschiedene alternativ gespleißte Isoformen, die in Größe, Länge und Domänenkomposition variieren. MACF1 Isoform-3 weist einen ungewöhnlichen N-Terminus auf, der auf neue Funktionen schließen lässt. Dieser ist aus einem einzigartig hoch konservierten 35 kDa N-Terminus aufgebaut, der direkt an die zweite Hälfte der Aktin-bindenden Domäne fusioniert ist. Die transiente Expression dieses N-Terminus inhibiert die Signaltransduktion der Rho-GTPasen. Durch die Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems und Expressionsstudien konnte eine Interaktion mit dem Zytoskelettmodulator RhoA gezeigt werden. Immunfluoreszenzstudien mit einem neu generierten polyklonalen MACF1 Isoform-3 Antikörper zeigten eine ungewöhnliche Lokalisierung um und innerhalb des Nukleus in verschiedenen Zelllinien und Geweben zusätzlich zu der gut charakterisierten Mikrotubuli Lokalisation. Permeabilisationassays mit Digitonin wiesen auf die Lokalisation von MACF1 Isoform-3 an der äußeren Kernhülle hin. Dort kolokalisiert MACF1 mit Nesprinen. Nesprine sind integrale Membranproteine der äußeren Kernhülle, die den Zellkern mit dem Zytoskelett verbinden. Durch GST-Proteininteraktions-, Immunpräzipitations-, Hefe-Zwei-Hybrid- und Expressionsstudien konnte eine Interaktion von MACF1 Isoform-3 mit Nesprin-3 gezeigt werden. Weiterhin deuten die Ergebnisse an, dass durch diese Interaktion MACF1 Isoform-3 Mikrotubuli an die Kernhülle transloziert und dort stabilisiert. Während der Mitose lokalisiert MACF1 Isoform-3 entlang der mitotischen Spindel. Durch Chromatin Immunpräzipitation und Expressionsstudien konnte eine neue Assoziation mit Chromatin und Laminen für MACF1 Proteine gezeigt werden. Weiterhin konnten erste Belege für Umlagerungen von MACF1 Isoform-3 gezeigt werden. Durch Zugabe von Wachstumsfaktoren (Wnt-3, HGF und TGFß) sowie durch Serumsentzung und Zugabe von Calzium-Ionen konnte in Immunfluoreszenzstudien die subzelluläre Verteilung von MACF1 Isoform-3 beeinflusst werden, wobei MACF1 Isoform-3 nach Serumentzug mit Mitochondrien kolokalisierte. Ein möglicher Interaktionspartner an den Mitochondrien ist DISC1 (Disrupted in Schizophrenia 1), das als high risk gene für die Entstehung von Schizophrenie gilt. Durch Hefe-Zwei-Hybrid (Carmago et al., 2006) Immunpräzipitations- und Expressionsstudien wurde eine Interaktion mit MACF1 Isoform-3 nachgewiesen. Diese Daten deuten an, dass MACF1 Isoform-3 eine mögliche Funktion in der Entstehung von Schizophrenie besitzt. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass MACF1 Isoform-3 eine wichtige Rolle in der Migration und Proliferation von Zellen ausübt und hierbei in die RhoA- und Wnt Signaltransduktion involviert ist

Finishing the euchromatic sequence of the human genome

The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as well as rich information about human evolution. In 2001, the International Human Genome Sequencing Consortium reported a draft sequence of the euchromatic portion of the human genome. Since then, the international collaboration has worked to convert this draft into a genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result of this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers ∼99% of the euchromatic genome and is accurate to an error rate of ∼1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods. The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the human enome seems to encode only 20,000-25,000 protein-coding genes. The genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades ahead