Improving sweetpotato virus diagnostics

This flyer describes progress made between June 2014 and July 2015 to develop an easily accessible distribution map of all relevant viruses and virus strains infecting sweetpotato throughout SSA as well as appropriate diagnostic methods and protocols to detect them. It provides details about a generic virus detection method developed at CIP called small RNA sequencing and assembly (sRSA) to determine all viruses infecting sweetpotato in SSA: the pan-African sweetpotato Virome; as well as two diagnostic methods for detecting sweetpotato viruses: micro-arrays in a test tube (ClonDiag arrays) and an isothermal amplification method (LAMP)

Diversidad fenotipica y genetica de cepas de Ralstonia solanacearum del Peru.

Ralstonia solacearum es el agente causal de la marchiez bacteriana. Esta enfermedad afecta numerosos cultivos de importancia economica especialmente en las regiones tropicales y sub tropicales. La amplia gama de hospsedantes, su distribucion y gran variabilidad del patogeno, hacen dificil el control de la enfermedad. Estudios sobre la variabilidad son importantes en mejoramiento para resistencia, competencia ecologica, manejo de la enfermedad y relaciones evolutivas y filogeneticas. El objetivo de este trabajo fue caracterizar fenotipica y genotipicamente 132 cepas de R. solanacearum aisladas de papa de distintos ecosistemas entre 1974 y 2013. La determinacion de biovares (Bv) se realizo en base a pruebas bioqumicas y se asigno el filotipo y secuevar correspondientemente mediante multiplex-PCR y- analisis de las consecuencias del gen endogluconasa. El analisis de datos se realizo por comparacion con las secuencias de las cepas de referencia depositadas en la base de datos del Gene Bank. Los resultados indican que el 100 % de las cepas del Peru corresponden al Filotipo II, el cual segun la clasificacion actual agrupa a las cepas originarias de America. Todas las cepas pertenecientes al biovar 2A (67.5 %) corresponden a los secuevares 1, 2. Este tipo de cepas tradicionamente presenta una baja variabilidad genetica y son las que afectan al cultivo de papa en zonas frias y templadas. El resto de las cepas analizadas fueron clasificadas dentro de los biovares (24.2%) y 2T (8.3%). Esta cepas presentaron una mayor variabilidad a nivel de secuencia y a la mayoria no se dudo asignar ningun secuevar conocido. Los resultados demuestan la diversidad de la poblacion R. solanacearum en el Peru. Infomacion valiosa que podria ayudar en las estrategias del control de la enfermedad

Detection of Ralstonia solanacearum (Rs) in latently infected potato stem extracts by post-enrichment qPCR.

A sensitive method for detection of Ralstonia solanacearum in latently infected potato stem extracts has been achieved by previous enrichment procedure followed by Real time PCR (qPCR). Sensitivity of qPCR before and after enrichment (48h of incubation of the stem extract with modified SMSA broth at 30oC) was compared with other techniques such as NCM-ELISA and R.solanacearum isolation in Kelman’s medium. Before enrichment procedure, 174.6 cells/ml were detected in Kelman’s medium, 1.71 x 106 cells/ml by NCM-ELISA and 1.29x105 cells/ by qPCR. After enrichment, sensitivities of post enrichment qPCR, NCM- ELISA and isolation on modified Kelman’s medium were similar. As few as 6.56 cells/ml were detected in latently infected potato stem extracts. Serial dilutions of naturally-infected stem extract before enrichment allowed the quantification of populations of R. solanacearum in each stem extract. Post –enrichment qPCR combines the advantages of high sensitivity, ease and speed, but it requires expensive laboratory equipment. Thus it can be used by seed and breeding programmes in developing countries only to confirm positive results obtained by serological tests used for seed quality control and for assessing susceptibility of breeding lines to bacterial wilt

Evaluacion del gen que codifica la enzima <beta>HPMEH para la inhibicion de la marchitez bacteriana causada por Ralstonia solanacearum.

La marchitez bacteriana causada por Ralstonia solanacearum E.F. Smith es una de las enfermedades bacterianas más importantes que ataca a cultivos agrícolas como papa, tomate, banana, entre otros, causando grandes pérdidas en la producción. Desafortunadamente, su control ha sido difícil por su amplio rango de hospederos alternativos, su supervivencia en el suelo y su variación biológica y genética; así como porque no hay variedades con altos niveles de resistencia y porque no existe un control químico efectivo. Quorum sensing (percepción de quorum) es el fenómeno mediante el cual la acumulación de unas moléculas permite a una bacteria saber el número de bacterias que se encuentran en el medio es decir la densidad poblacional. La bacteria R. solanacearum posee un sistema quorum sensing para la regulación de la expresión de genes de virulencia, y en la cual la molécula 3-OH-PAME es el autoregulador de esta señal. Se conoce que la molécula HPMEH hidroliza a 3-OH-PAME, anulando así la señal de autorregulación y por tanto la comunicación quorum sensing en R. solanacearum. Con el objetivo de evaluar el gen hpmeh, se diseñaron dos vectores que expresen este gen bajo el control de dos diferentes promotores, los cuales fueron verificados por análisis de restricción, secuenciamiento y posteriormente mediante técnicas de agroinfiltración, se observó su expresión y su efecto frente a R. solanacearum en hojas de papa de la variedad Desiree. Los resultados de la expresión transitoria, muestran que el gen hpmeh retrasó la aparición de síntomas de la marchitez bacteriana y sería un candidato potencial para transformación genética de la planta entera

Evaluacion de la estabilidad de resistencia de clones avanzados del CIP a la marchitez bacteriana usando diferentes variantes de Ralstonia solanacearum.

La marchitez bacteriana (MB) o pudricion parda causada por Ralstonia solanacearum es una de las enfermedades bacterianas mas destructivas en el cultivo de la papa. La resistencia de las plantas es el medio mas efectivo para controlar esta enfermedad. Sin embargo, la resistencia a la MB es a menudo superada debido a la gran variabilidad del patogeno. En el presente trabajo se evaluo la reaccion de 10 clones avanzados del CIP (seleccionados previamente por su resistencia al BV2A) contra 5 cepas correspondientes a los biovares 1, 2a, 2T y 3, de R. solanacearum bajo condiciones de invernadero. 15 plantas por clon de aproximadamente 15 cm de altura fueron inoculadas vertiendo en el suelo una suspension de 150 ml de la bacteria para obtener una concentracion final de 10 7 ufc/g suelo. Las variedades de papa Revolucion y CIP -01149 fueron utilizadas como control susceptible y moderadamente resistente, respectivamente. Las evaluaciones de la presencia de los sintomas de marchitez se realizaron semanalmente hasta 10 dias antes de la cosecha de los tuberculos. En plantas sin sintomas, los tallos y tuberculos fueron analizados mediante ELISA-NCM post-enriquecimiento para detectar infeccion latente. El analisis estadistico del porcentaje de plantas infectadas muestra diferencias significativas entre clones y cepas de R. solanacearum. No se observo resistencia completa (0% de infeccion) en ninguno de los clones evaluados a todas las cepas -de R. solanacearum. Sin embargo, el clon 394895.7 fue el mas resistente, mostrando un maximo de 13 % de infeccion cuando fue inoculado con la cepa mas virulenta (CIP-204). La resistencia a todas las cepas de R. solanacearum detectada en el clon 394895.7 muestra su alto potencial como una fuentes genetica de la resistencia a la marchitez bacterian

Caracterizacion molecular de aislamientos de sweepovirus que infectan Ipomoea batatas (L.) Lam. y estudio de sinergismo con el sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV).

Los sweepovirus forman un grupo dentro del genero Begomovirus que se caracterizan por infectar solo a camote, los cuales comunmente causan infeccion asintomatica, pasando inadvertidos, por lo que su prevalencia y distribucion es desconocida en algunas regiones del mundo. Las infecciones multiples son sinergicamente con otros virus. En el presente estudio, se obtuvieron 48 secuencias a partir de fragmentos de PCR usando cebadores universales para sweepovirus de un total de 239 muestras de camote mantenidas en el banco de germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP). Se seleccionaron y caracterizaron los genomas completos de seis aislamientos de sweepovirus: Peru-6, Mexico-31, Cuba-5, San Vicente, Peru-10 y Jamaica-12, utilizando PCR en sentido inverso para los cuatro primeros aislados y por la polimerasa Phi29 para los ultimos dos. La comparacion completa de los genomas confirmo que los seis virus eran bastante diferentes entre si con un 89 % de identidad a excepcion de Jamaica-12 y Cuba-5 (91 %), y San Vicente y Peru-10 (93 %). Se realizo una evaluacion del sinergismo de cada uno de ellos con el aislamiento M2-47 del SPCSV durante un periodo de 10 semanas. Esta se realizo mediante la expresion de sintomas en plantas de camote variedad "Huachano" con infecciones simples (sweepovirus) y dobles (sweepovirus + SPCSV). La deteccion de los sweepovirus se realizo mediante la prueba de hibridacion de acidos nucleicos y por RT-PCR en tiempo real el SPCSV. Se encontro que existe un sinergismo con una magnitud considerablemente variable entre los titulos de los diferente aislados de sweepovirus y que en la mayoria de los casos no se asocio con sintomas claros. La informacion obtenida en este estudio puede contribuir al diagnostico e identificacion de sweepovirus y el aumento de sus titulos presente en algunas interacciones sinergicas sugiere que pueden tener un impacto en el rendimiento y esto debe ser una prioridad para estudio futuros