Screening of microrganisms for transfructosylating activity and study of biochemical properties of fructosyltransferase from Penicillium sp.

Orientador: Glaucia Maria PastoreDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosAbstract: Impulsionados pela grande demanda por alimentos ¿saudáveis¿ e de calorias controladas, têm surgido desde os anos 80 um grande número de adoçantes alternativos e, entre eles, diversos oligossacarídeos. Entre os oligossacarídeos mais estudados estão os frutooligossacarídeos (FOS), que se tornaram mais importantes por suas propriedades funcionais que pelo seu poder adoçante. Os FOS podem ser produzidos por meio da reação de transfrutosilação catalisada pela enzima frutosiltransferase (FTase), onde uma molécula de sacarose é hidrolisada e o radical frutosil é transferido para outra sacarose. Diversos microrganismos possuem o gene que codifica para a FTase, e sua aplicação industrial já está bem estabelecida, contudo, o Brasil detém apenas uma pequena fração do total de patentes desses processos tecnológicos. Esse trabalho teve por objetivo selecionar novas linhagens microbianas produtoras de frutosiltransferase que sejam eficientes e competitivas com as já descritas na literatura. Para isso, novas linhagens de microrganismos foram isoladas do Baru, um fruto do cerrado. Inicialmente 54 linhagens foram avaliadas quanto à atividade de transfrutosilação, sendo identificadas 13 como potenciais produtoras de FTase. Cada uma das 13 linhagens foi testada com relação à síntese de FOS em diferentes tempos de reação (6, 12, 24, 48 e 72 h), tendo sido utilizadas preparações enzimáticas parcialmente purificadas. A FTase de Penicillium sp. apresentou o maior rendimento da reação de síntese de FOS (50%), sendo as condições de reação 500g.L-1 de sacarose, 20% de enzima (v/v), agitação de 100 rpm, temperatura de 50°C e tempo de reação de 48 horas, em tampão acetato 50 mM (pH 4,5). Baseando-se no rendimento da reação de síntese de FOS, essa linhagem de Penicillium sp. foi selecionada para realização de estudos dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da FTase. Foi utilizada a metodologia de superfície de resposta para avaliar as condições ótimas de atividade enzimática, sendo estas: pH de 4,8 a 5,2, 54 a 57°C e sacarose (410 a 520 g.L-1). Os parâmetros termodinâmicos tempo de meia vida (t1/2), constante de desnaturação (kd) e valor de redução decimal (D) foram determinados para cada uma das quatro temperaturas estudadas (45, 50, 55 e 60°C). A energia de ativação da desnaturação (Ead) e o valor z também foram calculados para a FTase. A enzima estudada apresentou inibição pelo substrato quando a concentração de sacarose foi superior a 400 g/L. Os parâmetros cinéticos vmax, km e ki foram estimados pelos métodos de linearização de Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen e pelo modelo de clássico de inibição combinado com o modelo de Hill utilizando o software Statistica® 8.0. A análise das constantes sugere que há um fenômeno de inibição que afeta a enzima e não foi possível a identificação de quais componentes do sistema reacional causam a inibição enzimática, utilizando apenas o modelo clássico de inibição, sendo necessários estudos futuros para desenvolver o modelo cinético adequado para a FTase. Os resultados obtidos indicam que a FTase de Penicillium sp. tem potencial para ser aplicada em processos industriais para produção de FOSAbstract: Nowadays, there is a high demand on health and low caloric food. Since the years of 1980 a big number of sweteners have appeared to replace sucrose. The fructooligosacchrides (FOS) are considered the most important sweeteners among them due their properties to promoting health by increasing of the amount of beneficial bacteria in human gut. They can be produced by simple transfructosilation reaction catalysed by fructosyltransferase (FTase), wherein one molecule of sucrose is hydrolyzed and the fructosyl radical is bonded to another sucrose. Some microorganisms have the gene encoding FTase and its industrial applications are well known. However, Brazil has a small share of patents registered around the world in these technological process. In this work, we aimed to find potential microorganisms strains that produce both FTase and FOS. New strains were isolated from Baru fruits of Brazilian Cerrado biome. Initially 54 isolated strains were screened for transfructosilating activity. As result it was found 13 strains which were able to produce FTase. Enzimatc extracts partially purified from each of 13 strains were evaluated in the ability to produce FOS in several reaction times (6, 12, 24, 48 and 72 h). The reaction conditions were 500 g.L-1 sucrose, 20% (v/v) enzime:solution, 100 rpm, 50°C and 48 h reaction time in acetate buffer 50 mM (pH 4,5). The Penicillium sp. FTase showed the highest yield of FOS synthesis. Hence this strain was selected to study the FTase kinetical and thermodynamical properties. The best conditions found using the Response Surface Methodology were: pH 4.8 to 5.2; 54 to 57°C and 410 to 520 g.L-1 sucrose. The thermodynamic parameters half-life (t1/2), denaturation constant (kd) and the decimal reduction time (D) were calculated to each of the four tested temperatures (45, 50, 55 e 60°C). The activation energy of denaturation (Ead) and the z-value were also calculated. This enzyme showed inhibition by substrate when the sucrose concentration was above 400 g.L-1. The kinetical parameters vmax, km e ki were estimated by Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen linearization methods. In addition, these constants were also estimated by classic model of inhibition combined with the Hill model using the StatisticaTM 8.0 software. The data analisys indicated an enzimatic inhibition fenomena. However, it was not possible to identify which agents triggered the enzimatic inhibition using only the classic model. It is necessary more future studies to elucidate the appropriated model to FTase. These results sugest that the FTase from Penicillium sp. has a great potential to be applied in further FOS industrial processesMestradoMestre em Ciência de Alimento

Functional and structural studies of bacterial glycosil hydrolases aiming applications in bioprocesses

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Fábio Márcio SquinaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande quantidade de energia estocada nessas matérias-primas. O etanol de cana-de-açúcar é uma das melhores opções em biocombustíveis e sua produção pode mais que dobrar, se os açúcares constituintes da parede celular vegetal forem utililizados. No entanto, o alto custo de produção das enzimas para hidrolisar e processar os materiais lignocelulósicos é um fator altamente limitante para o uso de tecnologias verdes. Este trabalho se propôs a avaliar novos biocatalisadores e construir uma enzima quimérica na tentativa de obter glicosidases com melhor desempenho que as já relatadas. Enzimas despolimerizadoras de ß-1,3-glucanos têm consideráveis aplicações biotecnológicas, incluindo produção de biocombustíveis, insumos químicos e farmacêuticos. No segundo capítulo, mostramos a caracterização funcional e a estrutura de baixa resolução da laminarase hipertermofílica de Thermotoga petrophila (TpLam), além de seu modo de operação por eletroforese capilar de zona, mostrando que ela cliva especificamente ligações ß-1,3-glucosídicas internas. O dicroismo circular (CD) UV-distante demonstrou que TpLam é formada principalmente por elementos estruturais do tipo beta, e a estrutura secundária é preservada após incubação por 16 horas a 90 º C. A forma determinada pelo pequeno espalhamento de raios-X a baixo ângulo revelou uma arquitetura de multi-domínio da enzima, com um arranjo de envelope em forma de V, no qual os dois módulos de ligação de carboidrato estão ligados ao domínio catalítico. A engenharia de enzimas multifuncionais pode melhorar coquetéis enzimáticos para tecnologias emergentes de biocombustíveis. Dinâmica molecular através de modelos baseados em estrutura (SB) é uma ferramenta eficaz para avaliar a disposição tridimensional das enzimas quiméricas, bem como para inferir a viabilidade funcional antes da validação experimental. No terceiro capítulo, descrevemos a montagem computacional de uma quimera bifuncional xilanase-liquenase (XylLich), usando os genes xynA e bglS de Bacillus subtilis. As análises in silico da área de superfície acessível ao solvente (SAS) e da raiz quadrada média das flutuações (RMSF) previram uma quimera completamente funcional, ou seja, uma enzima cujo substrato tem acesso ao seu sítio catalítico com pequenas flutuações e variações ao longo das cadeias polipeptídicas. A quimera preservou as características bioquímicas das enzimas parentais, com exceção de uma pequena variação na temperatura de operação e na eficiência catalítica (kcat / Km). Também foi verificado ausência de mudanças significativas no modo de operação catalítico. Além disso, a produção de enzimas quiméricas pode ser mais rentável do que a produção de uma única enzima separadamente, comparando-se o rendimento da produção de proteína recombinante e a atividade hidrolítica da enzima quimérica com as enzimas parentais. ß-Glicosidases (BGLs) são enzimas muito úteis e com grande potencial para serem empregadas em diversos processos industriais. Entretanto, algumas características são essenciais para tornar viáveis as aplicações, como por exemplo estabilidade à temperatura e ao pH, bem como baixa inibição por íons e outros compostos químicos. Assim, no quarto capítulo buscamos estudar três BGLs dos organismos extremófilos Pyrococcus furiosus e Thermotoga petrophila. Os genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 foram clonados no vetor pET28a e as proteínas expressadas em Escherichia coli e posteriormente purificadas em duas etapas cromatográficas. As enzimas purificadas foram avaliadas quanto ao pH e temperatura de atividade, sendo que as BGLs da família GH1 (PfBgl1 e TpBgl1) apresentaram faixas mais largas de pH e temperatura de operação do que a família GH3 (TpBgl3). As BGLs mostraram grande estabilidade ao pH e o maior tempo de meia-vida (a 99 ° C) foi verificado no pH 6, e além disso, não foram significativamente afetadas pela presença de EDTA ou de íons, exceto a TpBgl1 que foi inibida por Hg2+ e Fe2+. As atividades específicas para um conjunto de diferentes substratos sugeriram que TpBgl3 é mais específica que as BGLs GH1. O kcat e kcat / Km em 4-nitrofenol-ß-D-glicopiranosídeo (pNPG) indicam que TpBgl3 é a mais eficiente para hidrólise do substrato, embora seja a enzima que foi inibida com a menor concentração de glicose (30.1 mM). Além disso, as BGLs foram analisadas quanto à influência de seis monossacarídeos na catálise, e demonstraram serem fracamente inibidas pela maioria dos açúcares testados. Os ensaios de CD UV-distante revelaram que a estrutura secundária das BGLs não é afetada pelas variações de pH, e os estudos de desnaturação térmica evidenciaram que as BGLs são proteínas hipertermofílicasAbstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials. The ethanol from sugarcane is one of the best options concerning biofuels and its productivity could be raised more than double if the use of sugars constituents of plant cell wall is considered. However the high production cost of the enzymes to hydrolyze and process lignocellulose is a great limiting factor for green technologies. In this way, this work proposed to evaluate new enzymes and engineer a chimeric enzyme in the attempt to prospect glycosyl hydrolases with better performance than those reported up to date. 1,3-ß-Glucan depolymerizing enzymes have considerable biotechnological applications including the production of biofuels, feedstock-chemicals and pharmaceuticals. In the first chapter we showed the comprehensive functional characterization and low-resolution structure of hyperthermophilic laminarase from Thermotoga petrophila (TpLam), besides its mode of operation through capillary zone electrophoresis, which specifically cleaves internal ß-1,3-glucosidic bonds. Far-UV circular dichroism demonstrated that LamA is formed mainly by beta structural elements, and the secondary structure is maintained after incubation up to 16 hours at 90ºC. The structure determined by small angle X-ray scattering revealed a multi-domain structural architecture of the enzyme with a V-shape envelope arrangement of the two carbohydrate binding modules in relation to the catalytic domain. Multifunctional enzyme engineering can improve enzyme cocktails for emerging biofuel technology. Molecular dynamics through structure-based models (SB) is an effective tool for assessing the tridimensional disposal of chimeric enzymes as well as for inferring the functional practicability before experimental validation. In the second chapter we describe the computational design of a bifunctional xylanase-lichenase chimera (XylLich) using the xynA and bglS genes from Bacillus subtilis. In silico analysis of the average surface accessible area (SAS) and the root mean square fluctuation (RMSF) predicted a fully functional chimera, i.e. the substrate has access to the catalytic pocket with minor fluctuations and variations along the polypeptide chains. The chimera preserved the biochemical characteristics of the parental enzymes, with the exception of a slight variation in the temperature of operation and the catalytic efficiency (kcat/Km). The absence of substantial shifts in the catalytic mode of operation was also verified. Furthermore, the production of chimeric enzymes could be more profitable than producing a single enzyme separately, based on comparing the recombinant protein production yield and the hydrolytic activity achieved for XylLich with that of the parental enzymes. ß-Glucosidases (BGLs) are very useful enzymes with a great potential to be employed in several industrial processes. However, some features are required to become viable the enzyme applications, such as temperature and pH stability as well, low ions and chemicals inhibition. Thus this work aimed to study three BGLs from the extremophiles organisms Pyrococcus furiosus and Thermotoga petrophila. The genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 were cloned into pET28a vector and the proteins were expressed in Escherichia coli and further purified in two chromatographic steps. The purified enzymes were evaluated for pH and temperature of activity, which showed that BGLs from the glycosyl hydrolases family 1 (PfBgl1, TpBgl1) presented a wider range of pH and temperature operation than BGL from family 3 (TpBgl3). The BGLs showed great stability to a range of pH (4-10) and the highest time of half-life (at 99 °C) was at pH 6, besides they were not significantly affected by the presence of EDTA or ions, except TpBgl1 that was inhibited by Hg2+ and Fe2+. The specific activities in a set of different substrates suggested that TpBgl3 is more specific than GH1 BGLs. The kcat and kcat/Km in pNPG indicate that TpBgl3 is the most efficient among BGLs characterized herein, although this enzyme is inhibited with the lowest glucose concentration (30.1 mM). Furthermore, the BGLs were assayed for influence of six monosaccharides in catalysis, which the results suggested a weak inhibition by the most of those carbohydrates tested. The CD experiments revealed that the secondary structure of BGLs is not affected by the pH variations and the denaturation studies evidenced that the BGLs are indeed hyperthermophilicDoutoradoCiência de AlimentosDoutor em Ciência de Alimento

Effects Of High Pressure Homogenization On The Activity, Stability, Kinetics And Three-dimensional Conformation Of A Glucose Oxidase Produced By Aspergillus Niger.

High pressure homogenization (HPH) is a non-thermal method, which has been employed to change the activity and stability of biotechnologically relevant enzymes. This work investigated how HPH affects the structural and functional characteristics of a glucose oxidase (GO) from Aspergillus niger. The enzyme was homogenized at 75 and 150 MPa and the effects were evaluated with respect to the enzyme activity, stability, kinetic parameters and molecular structure. The enzyme showed a pH-dependent response to the HPH treatment, with reduction or maintenance of activity at pH 4.5-6.0 and a remarkable activity increase (30-300%) at pH 6.5 in all tested temperatures (15, 50 and 75°C). The enzyme thermal tolerance was reduced due to HPH treatment and the storage for 24 h at high temperatures (50 and 75°C) also caused a reduction of activity. Interestingly, at lower temperatures (15°C) the activity levels were slightly higher than that observed for native enzyme or at least maintained. These effects of HPH treatment on function and stability of GO were further investigated by spectroscopic methods. Both fluorescence and circular dichroism revealed conformational changes in the molecular structure of the enzyme that might be associated with the distinct functional and stability behavior of GO.9e10341

Produção biotecnológica de bioaromas e açúcares funcionais

Bioflavors and oligosaccharides are two classes of substances that may be produced biotechnologically through microbial bioprocesses. These compounds have attracted the interest of pharmaceutical and food industries not only due to their technological properties (sweetening/fiber or flavoring, respectively), but also as a consequence of other functional properties such as, for example, health promoting benefits. The use of agro-industrial residues as substrates in biotechnological processes seems to be a valuable alternative in helping to overcome the high manufacturing costs of industrial fermentations. This manuscript reviews the most important advances in biotechnological production of bioflavors and oligosaccharides. The use of some agro-industrial residues in such processes is also cited and discussed, showing that this is a rising trend in biotechnology.Bioaromas e oligossacarídeos são duas classes de substâncias que podem ser produzidas biotecnológicamente por meio de bioprocessos microbiológicos. Estes compostos têm atraído o interesse das indústrias farmacêutica e de alimentos não só devido às suas propriedades tecnológicas (adoçantes/fibras ou aromatizantes, respectivamente), mas também como consequência de outras propriedades funcionais como, por exemplo, benefícios na promoção da saúde. O uso de resíduos agroindustriais como substrato em processos biotecnológicos parece ser uma alternativa valiosa para superar os altos custos de manufatura envolvidos nas fermentações industriais. Este manuscrito faz uma revisão dos mais importantes avanços na produção biotecnológica de bioaromas e oligossacarídeos. O uso de alguns resíduos agroindustriais nestes processos também são citados e discutidos, mostrando que esta é uma tendência crescente na biotecnologia.071

Activity of the native and HPH-treated GO samples at different pH and temperatures 15°C (A), 50°C (B) and 75°C (C).

<p>Activity of the native and HPH-treated GO samples at different pH and temperatures 15°C (A), 50°C (B) and 75°C (C).</p

Effect of HPH treatment on the activity of GO at temperatures between 15 and 85°C (A) and in enzyme thermal resistance at 60°C (B).

<p>Effect of HPH treatment on the activity of GO at temperatures between 15 and 85°C (A) and in enzyme thermal resistance at 60°C (B).</p

Kinetic parameters determined by the Michaelis- Menten model.

<p>Kinetic parameters determined by the Michaelis- Menten model.</p

Effects of HPH treatment on GO conformation: UV absorption spectra (A) and Fluorescence emission spectra (B).

<p>Effects of HPH treatment on GO conformation: UV absorption spectra (A) and Fluorescence emission spectra (B).</p

The effect of glucose concentration on the GO reaction velocity.

<p>The effect of glucose concentration on the GO reaction velocity.</p