Analysis of human DNA bone: qualitative study of compact bone microstructure

Para a execução da etapa inicial da identificação médico-legal de restos humanos (antropometria e exame dos arcos dentários), faz-se necessária uma limpeza prévia da ossada, para a remoção de tecidos moles putrefeitos. Os casos não identificados por esses métodos tradicionais, poderão ser submetidos ao exame de DNA. No entanto, apesar do grande avanço da biologia molecular, utilizando a amplificação de DNA pela PCR, algumas limitações que afetam a habilidade de se obter DNA em restos humanos, permanecem. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi fornecer subsídios morfológicos para os analistas forenses, com ênfase na prática médico-legal, visando uma utilização mais eficiente do DNA obtido de osso compacto de restos humanos em decomposição ou já esqueletizados, sem tecidos moles aderidos. Foi realizado o estudo da microestrutura do tecido ósseo compacto femoral, de restos humanos em decomposição, ainda com tecidos moles, que foram limpos pela fervura em água (n = 7) e ossadas já esqueletizadas pela decomposição natural, que não foram fervidas (n = 8). Destes, seis ossadas foram provenientes de cemitério público regular, após 3 anos de inumação, 1 ossada proveniente da região amazônica, e 1 ossada de origem desconhecida. Estas duas ultimas, apresentado-se porosas ou quebradiças. As análises morfológicas de cortes histológicos foram coradas com hematoxilina e eosina e o DNA amplificado pela PCR para os loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A0, FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 e amelogenina. Os resultados da análise desses dois grupos foram comparados com os de cadáveres frescos (n = 5) do Serviço de Verificação de Óbitos da Capital. A fervura dos ossos, do modo como é realizada no Instituto Médico Legal de São Paulo, pode aumentar a eosinofilia da matriz óssea e, em alguns casos, pode promover a desagregação dos ósteons. Tal procedimento pode remover células, mas pode também remover possíveis inibidores da PCR, favorecendo a análise do DNA obtido destas amostras. O fator limitante para a obtenção e análise de DNA, em amostras de ossos limpos por fervura, é a quantidade exígua de células. Ossos não submetidos à fervura, após inumação por três anos ou há mais tempo em contato com a terra, podem apresentar alterações da microestrutura. No entanto, a presença de hemácias preservadas e núcleos de osteócitos nestas amostras, indica melhor preservação de células em relação às amostras de ossos fervidos. O fator limitante para a análise de DNA nestas amostras é a presença sugestiva de inibidores da reação de amplificação pela PCR. Restos humanos, sem tecidos moles, macroscópicamente não preservados (porosos e quebradiços), e não submetidos à fervura, apresentam alterações de perda de matriz mineralizada; no entanto, nestas amostras ainda é possível encontrar células preservadas. Os resultados obtidos no neste trabalho permitem traçar algumas estratégias para uma melhor utilização nos protocolos de extração e análise do DNA em osso compacto de restos humanos.To the first essential step to forensic identification of human remains (anthropological study of race, sex, age, etc) it is necessary a previous cleaning of the bones, to remove decomposing soft tissues. Medico-legal inconclusive or non identified cases, by using these traditional methods, could be subjected to DNA analysis. However, in spite of advances in human identification techniques, specially by PCR amplified DNA, some limitations that affect the ability to obtain DNA in human remains still persist. Therefore, the aim of this study was to provide additional support from morphological analysis, to help forensic analysts personnel to utilise more efficiently the DNA, extracted from compact bones of human remains in decomposition or already skeletonized corpse, it means without soft tissues, with special emphasis in the legal-medicine practice. Femoral compact bones were obtained from: 7 human remains found on the ground, in different degree of decomposition which were cleaned by boiling to remove soft tissues; also studied were collections of bones from 8 corpses having undergone natural decomposition: 6 human remains exhumed after 3 years from a common public cemetery in São Paulo City; 1 case from amazon region and 1 case with no information, both cases remained from long time (more than 3 years) in contact with soil. All eight cases, were not boiled as no soft tissue were adhered. As a control, five cadavers 12 to 16 hours post mortem were also used. The compact bones histological sections were stained by haematoxilin and eosin and the loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A01,FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 and amelogenin were amplified by PCR.The procedure for boiling the human remains utilised in the Legal Medicine Institute of São Paulo would have increased the eosinophily of bone matrix and, in some cases, promoted the desaggregation of the osteons. In addition these procedures would have removed the cells, but in some cases would have removed possible inhibitors of the PCR, favouring in this way the analysis of DNA obtained from these samples. The limiting factor to obtain successful analysis in bones submitted to boiling seem to be the low quantity of nuclei present in these samples. For the other hand, in bones not cleaned by boiling, the presence of preserved red cells and oscteocyte nuclei inside the lacunae indicates better preservation of cells in relation to those bones cleaned by boiling. The limiting factor to obtain successful DNA analysis in bones exhumed or in contact of soil, is the suggestive presence of inhibitors of PCR. Porous and brittle bones from human remains, without soft tissues that are not processed by boiling, present alterations through loss of mineralised matrix, although it is still possible to found preserved cells in these samples. The results presented in this work clarify concerns about viability of DNA for identification analysis. They also help to establish better strategies for optimisation of DNA extraction and analysis in compact bones of human remains

DNA analysis in forensic medicine, data bank and quality control

In the last years, with the development of the molecular biology and the DNA typing methods, forensic analysis have been used world wide to solve identity issues with considerable success. The authors describe the fast evolution of these techniques, the creation of data bank in some countries, discusses the need of rules and standard procedures of collection, preservation of the biological evidence samples and the quality control for adequate utilisation of this DNA typing analysis, as well as the perspectives for Brazil in this technological advanced scenario. The procedures of quality control and bioethics are emphasized to garantee and validate the use of this technique..As análises forenses com finalidade identificatória têm sido utilizadas com considerável sucesso nos últimos anos, graças aos acelerado avanço das técnicas de biologia molecular e métodos de tipagem de DNA. Os autores, após descrevem a rápida evolução dessas técnicas e a criação de bancos de dados DNA em alguns países, discutem a necessidade de normas, padronização, o controle de qualidade e os cuidados na coleta e preservação das amostras biológicas, para a adequada utilização dessa tipagem de DNA, bem como as perspectivas para o Brasil nesse cenário de avanço tecnológico. Abordam, também, os aspectos bioéticos que devem ser considerados na utilização dessa tecnologia

Identificação humana e análise de DNA em ossos

A introdução das técnicas de biologia molecular, ou seja a análise de DNA para identificação humana é um avanço recente na Medicina Legal. A identificação de cadáveres e restos humanos faz-se necessária após guerras, distúrbios sócio-políticos e desastres de massa. Além desses casos, devido à dinâmica social das grandes metrópoles, existem pessoas desaparecidas e por outro lado, cadáveres e restos humanos sem identificação são encontrados. Nos últimos anos, também tem ocorrido um aumento nas solicitações para coleta de material biológico de restos humanos exumados e destinados à determinação de vínculo genético em processos civis. Os autores realizam uma extensa revisão da literatura sobre a utilização dessas novas metodologias em ossos, antigos ou recentes, para a identificação humana.The introduction of molecular biology techniques, especially of DNA analysis, for human identification is a recent advance in legal medicine. Substantial effort has continuously been made in an attempt to identify cadavers and human remains after wars, socio-political problems and mass disasters. In addition, because of the social dynamics of large cities, there are always cases of missing people, as well as unidentified cadavers and human remains that are found. In the last few years, there has also been an increase in requests for exhumation of human remains in order to determine genetic relationships in civil suits and court action. The authors provide an extensive review of the literature regarding the use of this new methodology for human identification of ancient or recent bones

Tissue Microarray Analysis Applied to Bone Diagenesis

Taphonomic processes affecting bone post mortem are important in forensic, archaeological and palaeontological investigations. In this study, the application of tissue microarray (TMA) analysis to a sample of femoral bone specimens from 20 exhumed individuals of known period of burial and age at death is described. TMA allows multiplexing of subsamples, permitting standardized comparative analysis of adjacent sections in 3-D and of representative cross-sections of a large number of specimens. Standard hematoxylin and eosin, periodic acid-Schiff and silver methenamine, and picrosirius red staining, and CD31 and CD34 immunohistochemistry were applied to TMA sections. Osteocyte and osteocyte lacuna counts, percent bone matrix loss, and fungal spheroid element counts could be measured and collagen fibre bundles observed in all specimens. Decalcification with 7 % nitric acid proceeded more rapidly than with 0.5 M EDTA and may offer better preservation of histological and cellular structure. No endothelial cells could be detected using CD31 and CD34 immunohistochemistry. Correlation between osteocytes per lacuna and age at death may reflect reported age-related responses to microdamage. Methodological limitations and caveats, and results of the TMA analysis of post mortem diagenesis in bone are discussed, and implications for DNA survival and recovery considered

A importância da identificação humana nos desastres de massa naturais, acidentais ou provocados: uma abordagem multidisciplinar

Desastres de massa sempre existiram e agora ocorrem com maior frequência pela ação do homem. Dessaforma, consideramos importante a inclusão desse tema, tanto pelo caráter multidisciplinar dos trabalhos que se seguem aos desastres, em que profissionais das áreas da saúde, justiça e defesa civil estão envolvidos, bem como por ser do interesse de toda a sociedade. O escopo deste artigo é apresentar alguns dos principais acidentes de massa ocorridos nos últimos anos descritos na literatura enfocando as questões que se colocam aos profissionais nessas situações, bem como os avanços científicos e sua importância na identificação humana. Apresentamos: a) as dificuldades encontradas na identificação das vítimas dos ataques terroristas de 11 de setembro de 2001 no World Trade Center; b) o uso das técnicas para identificação de vítimas de guerras, genocídios; c) o uso das técnicas para identificação de vítimas de catástrofes naturais como o do Tsunami no Sul da Ásia em 26 de dezembro de 2004; d) a identificação do respomsável por um atentado em Jakarta em 2004: e) a Internet como ferramenta na vigilância da saúde na Geórgia em vítimas do furacão Katrina, ocorrido em 29 de agosto de 2005 e suas consequências. Como consideração final, apresentamos algumas recomendações, descritas após experiências vivenciadas em eventos dessa natureza.Mass Disasters have always occurred and now with more frequency by the action of man. Thus, we consider important the inclusion of this topic, both by the multidisciplinary aspect of the work that follows thedisasters, in which professionals from fields of health, justice and civil defense are involved, as well as to be of interest of the whole society. The scope of this paper is to present some of the main mass disasters in recent years published in the literature focusing on the issues in which professionals in these situations are involved, as well as the scientific advances and their significance for human identification. We present: a) the difficulties found in identifying victims of the terrorist attacks of September 11, 2001 at the World Trade Center; b) the use of techniques for identifying victims of wars, genocides; c) the use of techniques for identifying victims of natural disasters, as the tsunami in South Asia on December 26, 2004; d) the identification of the responsible of a mass disaster, in a bombing in Jakarta in 2004 and e) the Internet as a tool for monitoring the health in Georgia in Victims of Hurricane Katrina, occurred on August 29, 2005, and the event consequences. As the final consideration we present some recommendations, described after experiences in occurred events

Procedural and political aspects of forensic exhumation in Brazil

Exhumation may be defined as the legally sanctioned excavation and recovery of the remains of lawfully buried or – occasionally – cremated individuals, as distinct from forensic excavations of clandestinely buried remains conducted as part of a criminal investigation and from unlawful disinterment of human remains, commonly referred to as ‘bodysnatching’. The aim of this article is to review the role of exhumation – so defined – in the activities of CEMEL, the Medico-Legal Centre of the Ribeirão Preto Medical School-University of São Paulo, in international, regional and local collaborations. Exhumations form part of routine forensic anthropology casework; scientific research in physical and forensic anthropology; and forensic casework conducted in collaboration with the Brazilian Federal Police; and are carried out as part of humanitarian investigations into deaths associated with the civil–military dictatorship of 1964 to 1985. This article aims to offer a non-technical summary – with reference to international comparative information – of the role of exhumation in investigative and scientific work and to discuss developments in their historical and political context