Integrative study of the proteome throughout tomato fruit development

La tomate (Solanum lycopersicum) [...] présente de nombreux avantages : facilité de culture, temps de génération court, connaissances et ressources importantes, génome séquencé, facilité de transformation... Le développement du fruit est un procédé complexe hautement régulé et divisible en quatre étapes principales : la division cellulaire, l'expansion cellulaire, l’étape appelé « turning » et la maturation. Chaque étape est associée à un phénotype, qui lui-même découle de changements à différents niveaux cellulaires. [...]. Grâce aux récents progrès technologiques et en particulier au développement des «techniques omiques», comme la génomique, la transcriptomique, la protéomique, la métabolomique, les principaux composants cellulaires peuvent désormais être étudiés à haut densité. Dans ce contexte, l'objectif de mon doctorat était d'effectuer une analyse protéomique quantitative du développement du fruit de tomate puis d’intégrer les données «omiques» à la fois par des analyses statistiques et par la modélisation mathématique. Le premier chapitre rapporte les résultats de quantification du protéome de fruit de tomate réalisé en collaboration avec la plateforme PAPPSO (INRA, Gif-sur-Yvette). Des échantillons collectés à neuf stades de développement du fruit de tomate ont été extraits et le protéome quantifié, en absence de marquage, par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Ensuite, j'ai cherché la méthode la plus adaptée, testant un ensemble de filtres sur les données, pour obtenir une quantification précise des protéines à partir des intensités ioniques (XIC). Au total, j’ai pu obtenir la quantification absolue de 2494 protéines en utilisant une méthode basée sur la modélisation de l'intensité des peptides. [...] Le deuxième chapitre est consacré aux résultats obtenus par analyses combinées d’«omiques» au cours du développement du fruit de tomate. La transcriptomique a été réalisée en collaboration avec Genotoul GeT (Toulouse) et le groupe Usadel (RWTH Aachen University, Allemagne). Grâce à l’ajout d’étalons internes, plus de 20000 transcrits ont été quantifiés de manière absolue à chacune des neuf étapes de développement. Cette quantification a ensuite été validée par comparaison avec des données de concentration de 71 transcrits précédemment obtenues par PCR quantitative. Enfin, nous avons cherché à intégrer les quatre niveaux de données - transcriptome, protéome, métabolome et activome- afin d‘identifier les principales variables associées au développement. Pour ces quatre niveaux, les analyses ont confirmé que l’entrée en maturation s’accompagne de changements majeurs et révélé une grande similarité entre la fin et le début du développement, notamment au niveau du métabolisme énergétique. Le troisième chapitre porte sur les résultats de modélisation de la traduction protéique obtenus grâce à la quantification absolue du transcriptome et du protéome. Afin d’expliquer la corrélation décroissante observée au cours du développement entre les concentrations en protéines et celles des transcrits correspondants, nous avons résolu un modèle mathématique de la traduction protéique basé sur une équation différentielle ordinaire et impliquant deux constantes de vitesse: pour la synthèse et la dégradation de la protéine. La résolution de cette équation, validée par un critère de qualité basé un intervalle de confiance fermé, a conduit à l'estimation de ces constantes pour plus de 1000 protéines. [...] Enfin le dernier chapitre décrit l’ensemble du matériel et des méthodes utilisées pour obtenir les différents résultats présentés dans le manuscrit. Dans le domaine de la biologie des systèmes, ce travail illustre comment l'intégration de multiples données «omiques» et la modélisation mécanistique basée sur la quantification absolue des «omiques» peut révéler de nouvelles propriétés des composants cellulaires.The interest of the tomato (Solanum lycopersicum) fruit has spread in plant science where it is used as the model for fleshy fruit. The valuable advantages of the tomato fruit are numerous: an ease of culture, a short generation time, a high knowledge with important resources, a sequenced genome, an ease for transforming…. The development of tomato fruit is a complex regulated process, divided in four main steps: cell division, cell expansion, turning and ripening. Each step is characterized by a phenotype resulting from changes at different cellular levels. Thus, gene expression, protein abundance, enzyme activities, metabolic fluxes and metabolite concentrations show significant changes during these steps. Thanks to recent technologies advances and in particular the development of ‘omics techniques’, such as genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic, the main cell components can now be analysed by high-throughput. In this context, the objective of my PhD was to perform a quantitative proteomic analysis of the tomato fruit development and then integrate omics data both by statistical analyses and by mathematical modelling. The first chapter focused on results obtained for the quantitative proteomic developed in collaboration with the PAPPSO platform (INRA, Gif-sur-Yvette). Samples were harvested at nine stages of tomato fruit development, total proteome was extracted and quantified by label-free LC-MS/MS. Then I searched for the most appropriate method, testing a set of filters on the data, to obtain an absolute label-free protein quantification from ion intensities (XIC). Finally, I obtained the absolute quantification of 2494 proteins using a method based on peptides intensity modelling. The quantification of proteins by LC-MS/MS was then validated by comparison with 32 enzymatic capacities used as proxy for protein abundance. The second chapter was dedicated to the results of integrative omics analyses throughout tomato fruit development. First, transcriptomic has been performed in collaboration with Genotoul GeT (Toulouse) and Usadel‘lab (RWTH Aachen University, Germany). Using spikes in the experimental design, more than 20000 transcripts have been quantitatively determined at the nine stages of development. Then, this absolute quantification of the tomato transcriptome has been cross-validated with 71 transcripts previously measured by qRT-PCR. Finally, we integrated the four omics datasets- transcriptome, proteome, metabolome and activome – in order to identify key variables of the tomato fruit development. For the four levels, analyses confirmed that the entrance in maturation phase was accompanied by major changes, and revealed a great similarity between the end and the beginning of development, especially in the energy metabolism. The third chapter focuses on modelling results of the protein translation based on the absolute quantification of transcriptomic and proteomic. To explain the decreasing correlation observed between proteins and transcripts concentration throughout development, we proposed a mathematical model of protein translation based on an ordinary differential equation and involving two rate constants (for synthesis and degradation of the protein). The resolution of this equation, validated by a quality criteria based on a closed confidence interval, led to the estimation of the rate constants for more than 1000 proteins. These results were then compared with previous published data reported for plants and more widely in eukaryotic cells. Finally, the last chapter describes all the materials and methods used to obtain the results presented in the manuscript.In the systems biology context, this work illustrates how integration of multiple omics datasets and mechanistic modelling based on absolute omics quantification can reveal new properties of cellular component

Etude intégrative du protéome du fruit de tomate au cours de son développement

The interest of the tomato (Solanum lycopersicum) fruit has spread in plant science where it is used as the model for fleshy fruit. The valuable advantages of the tomato fruit are numerous: an ease of culture, a short generation time, a high knowledge with important resources, a sequenced genome, an ease for transforming…. The development of tomato fruit is a complex regulated process, divided in four main steps: cell division, cell expansion, turning and ripening. Each step is characterized by a phenotype resulting from changes at different cellular levels. Thus, gene expression, protein abundance, enzyme activities, metabolic fluxes and metabolite concentrations show significant changes during these steps. Thanks to recent technologies advances and in particular the development of ‘omics techniques’, such as genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic, the main cell components can now be analysed by high-throughput. In this context, the objective of my PhD was to perform a quantitative proteomic analysis of the tomato fruit development and then integrate omics data both by statistical analyses and by mathematical modelling. The first chapter focused on results obtained for the quantitative proteomic developed in collaboration with the PAPPSO platform (INRA, Gif-sur-Yvette). Samples were harvested at nine stages of tomato fruit development, total proteome was extracted and quantified by label-free LC-MS/MS. Then I searched for the most appropriate method, testing a set of filters on the data, to obtain an absolute label-free protein quantification from ion intensities (XIC). Finally, I obtained the absolute quantification of 2494 proteins using a method based on peptides intensity modelling. The quantification of proteins by LC-MS/MS was then validated by comparison with 32 enzymatic capacities used as proxy for protein abundance. The second chapter was dedicated to the results of integrative omics analyses throughout tomato fruit development. First, transcriptomic has been performed in collaboration with Genotoul GeT (Toulouse) and Usadel‘lab (RWTH Aachen University, Germany). Using spikes in the experimental design, more than 20000 transcripts have been quantitatively determined at the nine stages of development. Then, this absolute quantification of the tomato transcriptome has been cross-validated with 71 transcripts previously measured by qRT-PCR. Finally, we integrated the four omics datasets- transcriptome, proteome, metabolome and activome – in order to identify key variables of the tomato fruit development. For the four levels, analyses confirmed that the entrance in maturation phase was accompanied by major changes, and revealed a great similarity between the end and the beginning of development, especially in the energy metabolism. The third chapter focuses on modelling results of the protein translation based on the absolute quantification of transcriptomic and proteomic. To explain the decreasing correlation observed between proteins and transcripts concentration throughout development, we proposed a mathematical model of protein translation based on an ordinary differential equation and involving two rate constants (for synthesis and degradation of the protein). The resolution of this equation, validated by a quality criteria based on a closed confidence interval, led to the estimation of the rate constants for more than 1000 proteins. These results were then compared with previous published data reported for plants and more widely in eukaryotic cells. Finally, the last chapter describes all the materials and methods used to obtain the results presented in the manuscript.In the systems biology context, this work illustrates how integration of multiple omics datasets and mechanistic modelling based on absolute omics quantification can reveal new properties of cellular component.La tomate (Solanum lycopersicum) [...] présente de nombreux avantages : facilité de culture, temps de génération court, connaissances et ressources importantes, génome séquencé, facilité de transformation... Le développement du fruit est un procédé complexe hautement régulé et divisible en quatre étapes principales : la division cellulaire, l'expansion cellulaire, l’étape appelé « turning » et la maturation. Chaque étape est associée à un phénotype, qui lui-même découle de changements à différents niveaux cellulaires. [...]. Grâce aux récents progrès technologiques et en particulier au développement des «techniques omiques», comme la génomique, la transcriptomique, la protéomique, la métabolomique, les principaux composants cellulaires peuvent désormais être étudiés à haut densité. Dans ce contexte, l'objectif de mon doctorat était d'effectuer une analyse protéomique quantitative du développement du fruit de tomate puis d’intégrer les données «omiques» à la fois par des analyses statistiques et par la modélisation mathématique. Le premier chapitre rapporte les résultats de quantification du protéome de fruit de tomate réalisé en collaboration avec la plateforme PAPPSO (INRA, Gif-sur-Yvette). Des échantillons collectés à neuf stades de développement du fruit de tomate ont été extraits et le protéome quantifié, en absence de marquage, par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Ensuite, j'ai cherché la méthode la plus adaptée, testant un ensemble de filtres sur les données, pour obtenir une quantification précise des protéines à partir des intensités ioniques (XIC). Au total, j’ai pu obtenir la quantification absolue de 2494 protéines en utilisant une méthode basée sur la modélisation de l'intensité des peptides. [...] Le deuxième chapitre est consacré aux résultats obtenus par analyses combinées d’«omiques» au cours du développement du fruit de tomate. La transcriptomique a été réalisée en collaboration avec Genotoul GeT (Toulouse) et le groupe Usadel (RWTH Aachen University, Allemagne). Grâce à l’ajout d’étalons internes, plus de 20000 transcrits ont été quantifiés de manière absolue à chacune des neuf étapes de développement. Cette quantification a ensuite été validée par comparaison avec des données de concentration de 71 transcrits précédemment obtenues par PCR quantitative. Enfin, nous avons cherché à intégrer les quatre niveaux de données - transcriptome, protéome, métabolome et activome- afin d‘identifier les principales variables associées au développement. Pour ces quatre niveaux, les analyses ont confirmé que l’entrée en maturation s’accompagne de changements majeurs et révélé une grande similarité entre la fin et le début du développement, notamment au niveau du métabolisme énergétique. Le troisième chapitre porte sur les résultats de modélisation de la traduction protéique obtenus grâce à la quantification absolue du transcriptome et du protéome. Afin d’expliquer la corrélation décroissante observée au cours du développement entre les concentrations en protéines et celles des transcrits correspondants, nous avons résolu un modèle mathématique de la traduction protéique basé sur une équation différentielle ordinaire et impliquant deux constantes de vitesse: pour la synthèse et la dégradation de la protéine. La résolution de cette équation, validée par un critère de qualité basé un intervalle de confiance fermé, a conduit à l'estimation de ces constantes pour plus de 1000 protéines. [...] Enfin le dernier chapitre décrit l’ensemble du matériel et des méthodes utilisées pour obtenir les différents résultats présentés dans le manuscrit. Dans le domaine de la biologie des systèmes, ce travail illustre comment l'intégration de multiples données «omiques» et la modélisation mécanistique basée sur la quantification absolue des «omiques» peut révéler de nouvelles propriétés des composants cellulaires

Integrative study of the proteome throughout tomato fruit development

La tomate (Solanum lycopersicum) [...] présente de nombreux avantages : facilité de culture, temps de génération court, connaissances et ressources importantes, génome séquencé, facilité de transformation... Le développement du fruit est un procédé complexe hautement régulé et divisible en quatre étapes principales : la division cellulaire, l'expansion cellulaire, l’étape appelé « turning » et la maturation. Chaque étape est associée à un phénotype, qui lui-même découle de changements à différents niveaux cellulaires. [...]. Grâce aux récents progrès technologiques et en particulier au développement des «techniques omiques», comme la génomique, la transcriptomique, la protéomique, la métabolomique, les principaux composants cellulaires peuvent désormais être étudiés à haut densité. Dans ce contexte, l'objectif de mon doctorat était d'effectuer une analyse protéomique quantitative du développement du fruit de tomate puis d’intégrer les données «omiques» à la fois par des analyses statistiques et par la modélisation mathématique. Le premier chapitre rapporte les résultats de quantification du protéome de fruit de tomate réalisé en collaboration avec la plateforme PAPPSO (INRA, Gif-sur-Yvette). Des échantillons collectés à neuf stades de développement du fruit de tomate ont été extraits et le protéome quantifié, en absence de marquage, par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Ensuite, j'ai cherché la méthode la plus adaptée, testant un ensemble de filtres sur les données, pour obtenir une quantification précise des protéines à partir des intensités ioniques (XIC). Au total, j’ai pu obtenir la quantification absolue de 2494 protéines en utilisant une méthode basée sur la modélisation de l'intensité des peptides. [...] Le deuxième chapitre est consacré aux résultats obtenus par analyses combinées d’«omiques» au cours du développement du fruit de tomate. La transcriptomique a été réalisée en collaboration avec Genotoul GeT (Toulouse) et le groupe Usadel (RWTH Aachen University, Allemagne). Grâce à l’ajout d’étalons internes, plus de 20000 transcrits ont été quantifiés de manière absolue à chacune des neuf étapes de développement. Cette quantification a ensuite été validée par comparaison avec des données de concentration de 71 transcrits précédemment obtenues par PCR quantitative. Enfin, nous avons cherché à intégrer les quatre niveaux de données - transcriptome, protéome, métabolome et activome- afin d‘identifier les principales variables associées au développement. Pour ces quatre niveaux, les analyses ont confirmé que l’entrée en maturation s’accompagne de changements majeurs et révélé une grande similarité entre la fin et le début du développement, notamment au niveau du métabolisme énergétique. Le troisième chapitre porte sur les résultats de modélisation de la traduction protéique obtenus grâce à la quantification absolue du transcriptome et du protéome. Afin d’expliquer la corrélation décroissante observée au cours du développement entre les concentrations en protéines et celles des transcrits correspondants, nous avons résolu un modèle mathématique de la traduction protéique basé sur une équation différentielle ordinaire et impliquant deux constantes de vitesse: pour la synthèse et la dégradation de la protéine. La résolution de cette équation, validée par un critère de qualité basé un intervalle de confiance fermé, a conduit à l'estimation de ces constantes pour plus de 1000 protéines. [...] Enfin le dernier chapitre décrit l’ensemble du matériel et des méthodes utilisées pour obtenir les différents résultats présentés dans le manuscrit. Dans le domaine de la biologie des systèmes, ce travail illustre comment l'intégration de multiples données «omiques» et la modélisation mécanistique basée sur la quantification absolue des «omiques» peut révéler de nouvelles propriétés des composants cellulaires.The interest of the tomato (Solanum lycopersicum) fruit has spread in plant science where it is used as the model for fleshy fruit. The valuable advantages of the tomato fruit are numerous: an ease of culture, a short generation time, a high knowledge with important resources, a sequenced genome, an ease for transforming…. The development of tomato fruit is a complex regulated process, divided in four main steps: cell division, cell expansion, turning and ripening. Each step is characterized by a phenotype resulting from changes at different cellular levels. Thus, gene expression, protein abundance, enzyme activities, metabolic fluxes and metabolite concentrations show significant changes during these steps. Thanks to recent technologies advances and in particular the development of ‘omics techniques’, such as genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic, the main cell components can now be analysed by high-throughput. In this context, the objective of my PhD was to perform a quantitative proteomic analysis of the tomato fruit development and then integrate omics data both by statistical analyses and by mathematical modelling. The first chapter focused on results obtained for the quantitative proteomic developed in collaboration with the PAPPSO platform (INRA, Gif-sur-Yvette). Samples were harvested at nine stages of tomato fruit development, total proteome was extracted and quantified by label-free LC-MS/MS. Then I searched for the most appropriate method, testing a set of filters on the data, to obtain an absolute label-free protein quantification from ion intensities (XIC). Finally, I obtained the absolute quantification of 2494 proteins using a method based on peptides intensity modelling. The quantification of proteins by LC-MS/MS was then validated by comparison with 32 enzymatic capacities used as proxy for protein abundance. The second chapter was dedicated to the results of integrative omics analyses throughout tomato fruit development. First, transcriptomic has been performed in collaboration with Genotoul GeT (Toulouse) and Usadel‘lab (RWTH Aachen University, Germany). Using spikes in the experimental design, more than 20000 transcripts have been quantitatively determined at the nine stages of development. Then, this absolute quantification of the tomato transcriptome has been cross-validated with 71 transcripts previously measured by qRT-PCR. Finally, we integrated the four omics datasets- transcriptome, proteome, metabolome and activome – in order to identify key variables of the tomato fruit development. For the four levels, analyses confirmed that the entrance in maturation phase was accompanied by major changes, and revealed a great similarity between the end and the beginning of development, especially in the energy metabolism. The third chapter focuses on modelling results of the protein translation based on the absolute quantification of transcriptomic and proteomic. To explain the decreasing correlation observed between proteins and transcripts concentration throughout development, we proposed a mathematical model of protein translation based on an ordinary differential equation and involving two rate constants (for synthesis and degradation of the protein). The resolution of this equation, validated by a quality criteria based on a closed confidence interval, led to the estimation of the rate constants for more than 1000 proteins. These results were then compared with previous published data reported for plants and more widely in eukaryotic cells. Finally, the last chapter describes all the materials and methods used to obtain the results presented in the manuscript.In the systems biology context, this work illustrates how integration of multiple omics datasets and mechanistic modelling based on absolute omics quantification can reveal new properties of cellular component

The Quantitative Measurement of Peptidoglycan Components Obtained from Acidic Hydrolysis in Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria via Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Coupled with Mass Spectrometry

The high throughput in genome sequencing and metabolic model (MM) reconstruction has democratised bioinformatics approaches such as flux balance analysis. Fluxes’ prediction accuracy greatly relates to the deepness of the MM curation for a specific organism starting from the cell composition. One component is the cell wall, which is a functional barrier (cell shape, exchanges) with the environment. The bacterial cell wall (BCW), including its thickness, structure, and composition, has been extensively studied in Escherichia coli but poorly described for other organisms. The peptidoglycan (PG) layer composing the BCW is usually thinner in Gram− bacteria than in Gram+ bacteria. In both bacteria groups, PG is a polymeric mesh-like structure of amino acids and sugars, including N-acetylglucosamine, N-acetylmuramic acid, and amino acids. In this study, we propose a high-throughput method to characterise and quantify PG in Gram-positive and Gram-negative bacteria using acidic hydrolysis and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HILIC-MS). The method showed a relatively short time frame (11 min analytical run), low inter- and intraday variability (3.2% and 4%, respectively), and high sensitivity and selectivity (limits of quantification in the sub mg/L range). The method was successfully applied on two Gram-negative bacteria (Escherichia coli K12 MG1655, Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079) and one Gram-positive bacterium (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus DSM20259). The PG concentration ranged from 1.6% w/w to 14% w/w of the dry cell weight. The results were in good correlation with previously published results. With further development, the PG concentration provided by this newly developed method could reinforce the curation of MM

Peptide filtering differently affects the performances of XIC-based quantification methods

International audienc

Genome-scale metabolic modeling reveals metabolic trade-offs associated with lipid production in Rhodotorula toruloides.

Rhodotorula toruloides is a non-conventional, oleaginous yeast able to naturally accumulate high amounts of microbial lipids. Constraint-based modeling of R. toruloides has been mainly focused on the comparison of experimentally measured and model predicted growth rates, while the intracellular flux patterns have been analyzed on a rather general level. Hence, the intrinsic metabolic properties of R. toruloides that make lipid synthesis possible are not thoroughly understood. At the same time, the lack of diverse physiological data sets has often been the bottleneck to predict accurate fluxes. In this study, we collected detailed physiology data sets of R. toruloides while growing on glucose, xylose, and acetate as the sole carbon source in chemically defined medium. Regardless of the carbon source, the growth was divided into two phases from which proteomic and lipidomic data were collected. Complemental physiological parameters were collected in these two phases and altogether implemented into metabolic models. Simulated intracellular flux patterns demonstrated the role of phosphoketolase in the generation of acetyl-CoA, one of the main precursors during lipid biosynthesis, while the role of ATP citrate lyase was not confirmed. Metabolic modeling on xylose as a carbon substrate was greatly improved by the detection of chirality of D-arabinitol, which together with D-ribulose were involved in an alternative xylose assimilation pathway. Further, flux patterns pointed to metabolic trade-offs associated with NADPH allocation between nitrogen assimilation and lipid biosynthetic pathways, which was linked to large-scale differences in protein and lipid content. This work includes the first extensive multi-condition analysis of R. toruloides using enzyme-constrained models and quantitative proteomics. Further, more precise kcat values should extend the application of the newly developed enzyme-constrained models that are publicly available for future studies

Slow potentials encode intercellular coupling and insulin demand in pancreatic beta cells

Ion fluxes constitute a major integrative signal in beta cells that leads to insulin secretion and regulation of gene expression. Understanding these electrical signals is important for deciphering the endogenous algorithms used by islets to attain homeostasis and for the design of new sensors for monitoring beta cell function