Mikrobiološka analiza unutarnjeg i vanjskog zraka farme svinja u Slavoniji

Due to a large concentration of animals living in a relatively small area, air on pig farms can be contaminated by microorganisms which can have an adverse effect on animal and human health. To determine the microbiological air quality on a pig farm in Slavonia, as well as the differences in the microbiological air quality at different distances from the farm, air was sampled at five locations at the farm (nursery room, finishing rooms 1 and 2, service room, gestation room) and four locations at a distance of 1.5, 5, 10 and 15 m from the farm in July 2019. At each location, temperature and relative humidity were measured and air for microbiological analysis was collected in quadruplicates (n=36) by impaction method. The total aerobic mesophilic bacteria (AMB), as well as yeast and mould counts were determined on blood agar and Sabouraud dextrose agar, respectively, and expressed as CFU/m3. The AMB counts in all five farm locations, as well as the yeast and mould counts in nursery and finishing room 1 exceeded the reference values of 1.05x103 CFU/m3 for AMB and 4.1x102 CFU/m3 for yeasts and moulds. Overall, the AMB load was significantly higher (P0.05). In addition, the abundance of airborne AMB and yeasts and moulds decreased as the distance from the farm increased.Zbog velike koncentracije životinja u relativno malom prostoru, zrak na farmama svinja može biti kontaminiran mikroorganizmima koji mogu štetno utjecati na zdravlje životinja i ljudi. Kako bi se odredila mikrobiološka kvaliteta zraka unutar farme svinja u Slavoniji te mikrobiološka kvaliteta vanjskog zraka s porastom udaljenosti od farme, prikupljeni su uzorci zraka na pet lokacija unutar farme (uzgajalište, tovilište 1, tovilište 2, pripustilište i čekalište) te na četiri lokacije udaljene 1,5, 5, 10 i 15 m od farme tijekom srpnja 2019. Na svakoj lokaciji izmjerene su temperatura i relativna vlažnost te su uzeti uzorci zraka metodom impakcije u četiri ponavljanja (n=36). Ukupan broj aerobnih mezofilnih bakterija (AMB) određen je na krvnom agaru, dok je ukupan broj kvasaca i plijesni određen na Sabouraud dekstroznom agaru. Dobivene vrijednosti izražene su kao CFU/m3. Broj AMB u zraku na svih pet lokacija unutar farme te broj kvasaca i plijesni u uzgajalištu i tovilištu 1 bili su viši od dozvoljenih referentnih vrijednosti od 1,05x103 CFU/m3 za AMB i 4,1x102 CFU/m3 za kvasce i plijesni. Broj AMB u zraku nastambi bio je značajno veći (P0,05) u broju. Nadalje, broj AMB te kvasaca i plijesni u zraku smanjivao se s povećanjem udaljenosti od zgrade farme

Prediction of mycotoxigenic molds incidence on agricultural crops

Sinteza mikotoksina odvija se u specifičnim okolišnim uvjetima od kojih se temperatura, vlaga i CO2 navode kao ključni čimbenici za produkciju mikotoksina. Klimatske promjene te sve češći vremenski ekstremi značajno mijenjaju te čimbenike pa se posljedično narušavaju poznati obrasci kontaminacije plijesnima i sinteze mikotoksina na poljoprivrednim kulturama. Međutim, smatra se da će promjene povezane s kontaminacijom mikotoksikogenim plijesnima biti regionalne i usko u vezi s pojedinim vrstama plijesni, jer svaka vrsta ima svoje optimalne okolišne uvjete za rast i stvaranje toksičnih metabolita. Predviđa se da bi aflatoksini mogli postati učestali kontaminanti žitarica u Europi, a u tropskim predjelima moguće je izumiranje aflatoksikogenih plijesni zbog visokih temperatura. Za mikotoksikogene plijesni koje produciraju okratoksine, kao i za predstavnike roda Fusarium, također će biti izmijenjeni obrasci rasprostranjenosti i produkcije mikotoksina. Posebno zabrinjava porast prisutnosti plijesni F. graminearum, F. poae i F. langsethiae na žitaricama u sjevernoj i srednjoj Europi te posljedično kontaminacija tih usjeva deoksinivalenolom te T-2 i HT-2 toksinima. Pojavnost F. verticillioides i kontaminacija kukuruza fumonizinima bit će još više izražena na području južne Europe, kao i kontaminacija vina okratoksinima od plijesni A. carbonarius. S obzirom na očigledne klimatske promjene i posljedice koje one ostavljaju, nužna su daljnja istraživanja koja bi omogućila uspješno osmišljavanje strategija za prevenciju kontaminacije usjeva mikotoksinima u budućnosti.Mycotoxin synthesis takes place in specific environmental conditions, where temperature, humidity, and CO2 are considered the key factors in mycotoxin production. Due to climate change and increasingly frequent weather extremes those factors significantly change, hence, the previously established patterns of mold contamination and mycotoxin synthesis in agricultural crops are disrupted. However, the changes in mycotoxigenic mold contamination are expected to have a regional character, closely dependent on individual mold species, as each species grows and synthesizes toxic metabolites at optimal environmental conditions. Aflatoxins are predicted to become frequent grain contaminants in Europe, whilst the aflatoxigenic molds could go extinct in the tropics due to high temperatures. Also, the distribution and mycotoxins synthesis patterns of mycotoxigenic molds that produce ochratoxins and the members of the Fusarium genus will be modified. The increased presence of the molds F. graminearum, F. poae, and F. langsethiae on grains in northern and central Europe and the consequent contamination of these crops with deoxynivalenol and T-2 and HT-2 toxins are particularly concerning. The occurrence of F. verticillioides and maize contamination with fumonisins will be even more pronounced in southern Europe, as well as the contamination of wine with ochratoxins produced by A. carbonarius. Given climate change and its consequences, further research is necessary to design strategies for preventing crop contamination with mycotoxins in the future

Proteolitički soj Lactococcus lactis i lipolitički soj Enterococcus durans, izolirani iz tradicionalnog sira i upotrijebljeni kao funkcionalne mesne starter kulture

Research background. As fermentation is an integral feature of both, dry sausage and cheese production, this has led to the evaluation of bacterial cultures Lactococcus lactis ssp. cremoris (LL8307) and Enterococcus durans (ED0207) originally isolated from artisanal Croatian hard type cheese to diversify the range of flavours of dry fermented sausages and to increase their microbiological safety. Both strains were chosen for their high or medium acidifying, proteolytic and/or lipolytic activity and bioprotective potential after step-by-step selection of wild isolates. Therefore, this study aims to evaluate the survival rate of selected starter cultures in wild boar meat sausages during the ripening period of 40 days at a local small-scale facility under artisanal conditions as well as their influence on sausage quality parameters. Experimental approach. Safety, biotechnological and probiotic properties of twenty-three enterococcal and lactococcal isolates of dairy origin were studied. Based on the results, two best candidates were selected and added to the meat batter during the artisanal wild boar meat sausage preparation where their survival rate, effect on physicochemical, microbiological and sensorial properties and histamine content were evaluated. Results and conclusions. As revealed by repetitive element-polymerase chain reaction (rep-PCR), native starter cultures survived up to 15 days of ripening and were either absent from (LL8307) or reduced by 80% (ED0207) in final products. The application of native starter cultures rapidly decreased pH (p<0.05), leading to the significantly lower load of E. coli, coliforms and Enterobacteriaceae in ready-to-eat sausages prepared by the addition of starter cultures (3.04-3.94 log CFU/g) than in the control (3.88-5.00 log CFU/g). Analysis of hedonic test data revealed that some of the sensory traits (odour, flavour, juiciness) of treatments with starter cultures were highly liked by the higher percentage of consumers. The results suggest that these starter cultures would represent a valuable tool to improve the homogeneity of artisanal manufacture and hygienic quality of fermented sausages and can be safely used for food application. Novelty and scientific contribution. This is the first study to explore in depth the biotechnological potential of bacterial cultures isolated from artisanal Croatian cheese as functional starter cultures for high-quality game meat sausage production.Pozadina istraživanja. S obzirom na to da se fermentacija podjednako koristi za dobivanje trajnih kobasica i tvrdih sireva, bakterijske kulture Lactococcus lactis ssp. cremoris (LL8307) i Enterococcus durans (ED0207) izolirane su iz tradicionalnih hrvatskih tvrdih sireva, te detaljno okarakterizirane radi postizanja palete okusa trajnih fermentiranih kobasica i povećanja njihove mikrobiološke sigurnosti. Oba soja su odabrana nakon postupne selekcije autohtonih izolata zbog njihove velike ili srednje velike sposobnosti zakiseljavanja, proteolitičke i/ili lipolitičke aktivnosti, te moguće biozaštitne uloge. Stoga je svrha ovog istraživanja bila procijeniti stopu preživljavanja odabranih starter kultura u kobasicama od mesa divlje svinje tijekom perioda zrenja od 40 dana pri tradicionalnim uvjetima proizvodnje, te ispitati njihov utjecaj na parametre kakvoće kobasica. Eksperimentalni pristup. Ispitana su sigurnosna, biotehnološka i probiotička svojstva dvadeset i triju izolata enterokoka i laktokoka podrijetlom iz hrvatskih tradicionalnih tvrdih sireva. Na osnovi dobivenih rezultata izabrana su dva najbolja kandidata, koja su dodana nadjevu kobasica od mesa divlje svinje, te je procijenjena stopa preživljavanja izolata, njihov utjecaj na fizikalno-kemijska, mikrobiološka i senzorska svojstva kobasica te udjel histamina. Rezultati i zaključci. Analizom ponavljajućih elemenata lančane reakcije polimerazom (rep-PCR) utvrđeno je da su autohtone starter kulture preživjele u kobasicama do 15 dana zrenja, a da ih nije bilo (soj LL8307) ili je njihov broj bio reduciran za 80 % (soj ED0207) u gotovim proizvodima. Primjena odabranih starter kultura brzo je smanjila pH-vrijednost kobasica (p<0,05) i znatno smanjila broj E. coli, koliforma i enterobakterija u gotovim proizvodima pripremljenim s dodatkom starter kultura (3,04-3,94 log CFU/g), u usporedbi s kontrolnim uzorkom (3,88-5,00 log CFU/g). Analiza rezultata hedonističkog testa otkrila je da su se neke od senzornih osobina (miris, okus, sočnost) kobasica proizvedenih s odabranim starter kulturama svidjele većem broju potrošača. Rezultati upućuju na zaključak da ove starter kulture mogu pridonijeti standardizaciji proizvodnje i poboljšanju higijenske ispravnosti tradicionalnih fermentiranih kobasica, te da se mogu sigurno primijeniti u proizvodnji hrane. Novina i znanstveni doprinos. Ovo je prva studija koja je detaljno istražila biotehnološki potencijal bakterijskih kultura izoliranih iz tradicionalnog hrvatskog sira i upotrijebljenih kao funkcionalne starter kulture u proizvodnji visokokvalitetnih kobasica od mesa divljači

Characterization of Enterococcal Community Isolated from an Artisan Istrian Raw Milk Cheese: Biotechnological and Safety Aspects

U ovom su radu istraženi prevalencija, biotehnološki i sigurnosni profil 588 izolata enterokoka prikupljenih iz uzoraka sirovog mlijeka te istarskog sira tijekom zrenja. Unatoč sporadičnoj i varijabilnoj prisutnosti enterokoka u mlijeku ((3,65±2,93) log CFU/mL), nakon 30 dana sazrijevanja sira broj enterokoka je usporedivo visok ((7,96±0.80)) log CFU/g), što potvrđuje da su enterokoki sastavni dio temeljne mikrobiote istarskog sira. Dominantne vrste enterokoka identificirane su kao E. faecium (53,8 %) i E. faecalis (42,4 %), dok su vrste E. durans (2,84 %) i E. casseliflavus (0,95 %) bile zastupljene u manjem broju. Na temelju analize obrazaca metoda otiska prsta (RAPD-PCR), ustanovljena je i velika varijabilnost unutar vrste te detektirano 35 sojeva (genotipova). Većina sojeva bila je specifična za određenu farmu, dok je jedna trećina genotipova detektirana u uzorcima svih šest istraživanih farmi. Ova varijabilnost sojeva odraz je razlika u tehnologiji proizvodnje istarskog sira na različitim farmama, kao što su: različita koncentracija soli, temperatura i relativna vlažnost zraka tijekom zrenja sira, te mikroklimatski ili vegetacijski uvjeti. Među sojevima iste vrste utvrđena je znatna varijabilnost u pogledu biotehnoloških karakteristika, kao i značajne razlike u sposobnosti preživljavanja u simuliranim gastrointestinalnim uvjetima. Znatan broj sojeva bio je otporan na klinički važne antibiotike, kao što su tetraciklin (43,56 %), eritromicin (35,79 %) i vankomicin (23,48 %). Analizom lančane reakcije polimerazom (PCR) nije detektirana niti jedna od genskih determinanti za otpornost na vankomicin i eritromicin; za tetraciklin je detektiran gen tetM.In this study, prevalence, biotechnological and safety profiles of 588 Enterococcus isolates isolated from raw milk and Istrian cheese during different stages of ripening were analyzed. Despite the low and variable presence of enterococci in milk ((3.65±2.93) log CFU/mL), highly comparable enterococcal populations were established after 30 days of cheese ripening ((7.96±0.80) log CFU/g), confirming Enterococcus spp. as a major part of the core microbiota of Istrian cheese. The dominant species were E. faecium (53.8 %) and E. faecalis (42.4 %), while minor groups, consisting of E. durans (2.84 %) and E. casseliflavus (0.95 %), also occurred. A pronounced intraspecies variability was noticed based on molecular fingerprinting, with 35 strains (genotypes) detected. Most of the genotypes were farm-specific with one third being shared between the farms. This genotype variability reflected particular differences of Istrian cheese production, mainly variable salt concentration, ripening temperature and air humidity as well as microclimatic or vegetation conditions. There was considerable variation between the strains of the same species regarding wide range of biotechnologically important traits as well as their ability to survive in simulated gastrointestinal conditions. A considerable number of strains were resistant to critically important antibiotics such as tetracycline (43.56 %), erythromycin (35.79 %) and vancomycin (23.48 %). Polymerase chain reaction-based detection did not identify any of the common genetic determinants for vancomycin and erythromycin resistance; for tetracycline tetM gene was detected. The presence of virulence genes including agg, efaAfs, gelE, cylM, cylB, cylA, esp, efaAfm, cob and cpd was frequently recorded, especially among E. faecalis strains

Utjecaj minerala glina na uspostavu mikrobnih zajednica koje pokreću kruženje nutrijenata u ranim fazama razvoja tla

Soil is an integral part of every terrestrial ecosystem where it facilitates various ecosystem processes, including nutrient cycling (carbon (C), nitrogen (N)), and turnover (phosphorus (P)). The interaction between soil microbiota and soil constituents, such as clay minerals and organic matter leads to the formation of hotspots of microbial diversity and activity. Moreover, microbial metabolism actively shapes the habitat in which they live and influences soil formation together with other physical, chemical, and biological factors. Soil formation is a lengthy process based on the interaction of complex physical, chemical, and biological processes where microorganisms play an essential role as they drive nutrient availability and nutrient storage mainly if no plants are available. Furthermore, microbial diversity and function in the soil are affected by various abiotic and biotic factors, including mineral composition, and clay minerals in particular. Even though it was shown that different minerals can support and select different microorganisms, thus shaping the microbial community and function in soils, it is unknown how clay minerals influence the establishment, diversity, and adaptation of functional microbiota involved in nutrient cycling and turnover in the early stages of soil development. Therefore, this research aimed to improve our understanding of how clay minerals impact the establishment and diversity of microbial communities driving C, N, and P turnover during the early stages of soil development by combined analyses of the bacterial abundance and diversity with qPCR and T-RFLP respectively, and an in-depth analyses of microbial diversity and functional genes involved in C and N cycling, and P turnover based on a metagenomic shotgun sequencing of artificial soil microbiota. This study using artificial soils of different mineralogy (montmorillonite (MT), illite (IL), montmorillonite+charcoal (MT+CH), and illite+ferrihydrite (IL+FH)) has shown that soil properties, clay mineral composition in particular, strongly influence the establishment of different microbial communities during soil development. However, only two clay minerals (MT and IL) with different specific surface areas and charges that influence the nutrient availability, showed a strong effect on the bacterial community structure and function over the long-term incubation. Similar values of total organic C (13.5 ± 0.9 in MT and 11.6 ± 0.7 in IL), total N (1.5 ± 0.1 in MT and 1.3 ± 0.2 in IL), and total P (396 ± 20 in MT and 384 ± 29 in IL) content were detected in both soils. Consequently, the C:N:P ratios were very similar as well (82:7:1 in MT and 90:11:1 in IL) indicating C, N and P depleted system. However, based on the analysis of genes present in both soils, it is obvious that microorganisms have developed different strategies to overcome nutrient depletion in MT and IL. The degradation of recalcitrant C compounds such as cellulose (bglX, bglB) and chitin (nagZ, hexA-B, hex), N depolymerisation, and mineralization (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB) and assimilation (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2), together with effective P uptake and use of the internal poly-P pool (ppa, ppx, pstSCAB) were characteristic for MT. In contrast, starch (amyA) and chitin (chiA, CHIT1) were preferable C sources in IL. Furthermore, the higher abundance of denitrification related genes (narG, nirS, nifH) in IL indicates that N depletion was potentially overcome by the more efficient consumption of alternative N sources, such as chitin (chiA, CHIT1) when compared to MT. Lastly, higher abundances of genes encoding alkaline phosphatases (phoA, phoD), glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (ugpQ), and glycerol-3-phosphate transporter system (ugpBAEC) indicate that IL microbiota utilizes organic P sources to overcome P depletion. Overall, the results of this study significantly contribute to better understand the effect of clay minerals on the establishment of microbial communities that drive nutrient turnover, revealing different microbial strategies in adapting to and overcoming nutrient depletion during the early phases of soil development.Tlo je heterogena smjesa različitih mineralnih, organskih i bioloških komponenti i kao takvo predstavlja jedno od najsloženijih staništa u kojem mikroorganizmi obitavaju. Interakcije između mikroorganizama i čvrste faze tla, kao što su minerali glina i organska tvar uzrokuju stvaranje reaktivnih ploha koje predstavljaju žarišta mikrobne raznolikosti i aktivnosti. Sama veličina i fizikalno-kemijska svojstva ovakvih mikrostaništa ovise o izvornom matičnom supstratu. Među abiotičkim čimbenicima koji utječu na karakteristike mikrostaništa, ističe se mineralni sastav tla, točnije minerali glina. Dokazano je da minerali glina utječu na biogeokemijsko kruženje i mobilizaciju hranjivih tvari, kao što su ugljik (C), dušik (N) i fosfor (P). Prisutni su u svim tlima i sedimentima gdje tvore glavnu frakciju koja utječe na veličinu specifičnih reaktivnih površina. Smatraju se regulatorima kationske izmjene i mjestom adsorpcije organskih i anorganskih spojeva, čime utječu na dostupnost hranjivih tvari te posljedično na preživljavanje, metabolizam i funkciju mikroorganizama. Stoga, različiti mikroorganizmi naseljavaju tla s različitim mineralnim sastavom. Mikroorganizmi svojim metabolizmom aktivno mijenjaju stanište u kojem obitavaju te utječu na razvoj tla zajedno s ostalim biološkim, fizikalnim i kemijskim čimbenicima. Istovremeno, mikroorganizmi imaju središnju ulogu u biogeokemijskom kruženju svih kemijskih elemenata, među kojima se ugljik, dušik i fosfor smatraju esencijalnima. Njihova uloga u kruženju kemijskih elemenata je od posebnog značaja u ranim fazama razvoja tla. Obzirom da ugljik i dušik ne nalazimo u izvornom matičnom supstratu, potencijalni izvori ugljika i dušika u tlu uključuju taloženje organskih tvari i fiksaciju ugljika odnosno dušika od strane autotrofnih mikroorganizama. Fosfor, s druge strane, je prisutan u ranim fazama razvoja tla, prvenstveno u anorganskom obliku kao sastavni dio matičnog supstrata, te stoga njegova mobilizacija ovisi isključivo o mineralnom trošenju supstrata koje pak ovisi o aktivnosti i sposobnosti otapanja i mineralizacije od strane mikroorganizama. Međutim, još uvijek se ne zna u kojoj mjeri minerali glina utječu na sastav, razvoj i adaptaciju mikrobiote uključene u kruženje makronutrijenata u ranim fazama razvoja tla, zatim koje funkcionalne mikrobne grupe pokreću kruženje tvari u osiromašenim ekosustavima te koje procese i mehanizme koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Na temelju navedenog postavljene su sljedeće hipoteze: u umjetnim tlima različitog mineralnog sastava razvit će se različite mikrobne zajednice (H1), produžena inkubacija umjetnih tala dovest će do iscrpljenja bioraspoloživih oblika ugljika, dušika i fosfora i postupne prilagodbe i razvoja mikrobnih zajednica sposobnih iskorištavati teško dostupne oblike C, N i P (H2), nedostatak bioraspoloživog ugljika uzrokovat će adaptaciju mikrobnih gena uključenih u kruženje ugljika (H3), mikrorganizmi će nadvladati nedostatak bioraspoloživog N i P recikliranjem organskog N i P i efikasnijim unosom N i P u mikrobne stanice (H4) i konačno, funkcionalna mikrobiota sastojat će se primarno od tzv. generalista odnosno mikrobnih grupa prilagođenih širokom spektru ekoloških čimbenika sa sposobnošću iskorištavanja različitih izvora hranjiva među kojima će samo nekoliko grupa pokretati sve procese uključene u kruženje C, N i P, dok će zastupljenost specijalista tj. uskospecijaliziranih mikrobnih grupa koje pokreću neki specifičan proces u kruženju C, N i P biti će zanemariva (H5). Stoga, ciljevi ovog rada su ispitati utjecaj minerala glina na uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica, identificirati procese i mikrobne grupe koje pokreću kruženje makronutrijenata tijekom ranih faza razvoja tla i identificirati mehanizme koje mikroorganizmi koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Za ispitivanje postavljenih hipoteza korištena su dva pristupa. Utjecaj minerala glina na dostupnost hranjivih tvari, bakterijsku brojnost te uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica (H1) ispitan je u preliminarnom eksperimentu u kojem su pripremljena umjetna tla (n=4) koja se međusobno razlikuju po sastavu minerala gline. Ova tla su, uz kvarcni pijesak i prah, sadržavala jednu od sljedećih komponenti koje se često pojavljuju u prirodi: monmorilonit (MT), ilit (IL), montmorilonit+drveni ugljen (MT+CH) ili ilit+ferihidrit (IL+FH). Za svako umjetno tlo pripremljeno je 9 nezavisnih ponavljanja, mase do 500 g. Na početku eksperimenta, svako je umjetno tlo inokulirano mikrobnim inokulatom koji potječe od Ap horizonta prirodnog luvisola i sterilnim stajskim gnojem. Sterilni stajski gnoj je ponovno dodan svim umjetnim tlima 562. dan inkubacije. Inkubacija umjetnih tala završena je nakon 842 dana. Pretpostavljano je da će se do ovog trenutka, ovisno o tipu minerala glina, formirati mikro- i makro-agregati usporedivi onima u prirodnim tlima. Ovako pripremljenim umjetnim tlima potom je dodan biljni materijal u triplikatima. Kako bi se provjerilo da li su umjetna tla usporediva s prirodnim tlom, jedan uzorak luvisola (Scheyern) je u triplikatima tretiran biljnim materijalom. Istovremeno, pripremljene su i kontrole koje su se od umjetnih tala i luvisola razlikovale samo po tome što im nije dodan biljni materijal. Sva tla su dodatno inkubirana tijekom 63 dana u mraku, uz održavanje stalne vlage. Uzorci su uzeti 0., 7., 21. i 63. dan nakon dodavanja biljnog materijala. Utjecaj minerala gline na dostupnost ugljikovih spojeva i aktivnost mikroorganizama određena je na temelju WEOC (organski C koji se može ekstrahirati vodom) vrijednosti, brojnost na temelju Cmic vrijednosti i kvantifikacijom 16S rRNA gena, a raznolikost bakterijskih zajednica na temelju T-RFLP analize 16S rRNA gena amplificiranog početnicama 6-FAM-27f i 1401r. Primijećeno je da u svim umjetnim tlima, bez obzira na prisutne minerale gline, WEOC vrijednosti opadaju odmah nakon dodatka biljnog materijala, što se može objasniti povećanom mikrobnom aktivnošću i trenutnim iskorištavanjem lako dostupnog ugljika od strane mikroorganizma. Iako je isti trend zamijećen u svim umjetnim tlima, nešto niže WEOC vrijednosti su detektirane u umjetnim tlima koja sadrže MT u usporedbi s tlima koja sadrže IL, što ukazuje na bržu izmjenu hranjivih tvari u MT, kao i nešto višom stopom mikrobne respiracije. U prirodnom tlu, s druge strane, opadanje WEOC vrijednosti je detektirano tek kasnije tijekom inkubacije, u usporedbi s umjetnim tlima, što se može pripisati bolje razvijenim strukturama u prirodnom tlu i organskoj tvari koje bolje i brže vežu raspoložive ugljikove spojeve te ih na taj način privremeno štite od mikrobnog djelovanja. U svim umjetnim tlima, kao i u prirodnom tlu tretiranim biljnim materijalom, mikrobna biomasa se povećala od 0. do 7. dana inkubacije, što je vidljivo iz porasta Cmic vrijednosti, i u skladu je s dinamikom WEOC vrijednosti. Bakterijska brojnost, kao što je vidljivo iz broja 16S rRNA kopija gena g-1 suhe tvari tla, povećava se u MT, MT+CH i IL+FH umjetnim tlima tek kasnije tijekom inkubacije. Iako su i Cmic i broj kopija gena 16S rRNA odraz mikrobne biomase, nesklad između rezultata može se pripisati metodološkim razlikama. Obzirom da je u svim umjetnim tlima detektiran sličan trend u kretanju WEOC i Cmic vrijednosti te broju 16S rRNA gena, nije bilo moguće potvrditi H1 hipotezu isključivo na temelju tih parametara. Konačno, na temelju PCA analize T-RF fragmenata 16S rRNA gena, vidljivo je da se bakterijske zajednice u umjetnim tlima značajno razlikuju od bakterijskih zajednica u luvisolu. Nadalje, iz ovih rezultata je vidljivo da na uspostavu i razvoj bakterijskih zajednica u umjetnim tlima najviše utječu minerali gline MT i IL, što se može objasniti razlikama u fizikalno-kemijskim karakteristikama, prvenstveno razlikama u specifičnoj površini i naboju minerala gline, što pak utječe na dostupnost hranjivih tvari mikroorganizmima. Stoga, ovi rezultati potvrđuju hipotezu (H1) da određene grupe mikroorganizama preferiraju određene tipove minerala gline, te da posljedično prisutnost minerala gline u tlu utječe na uspostavu, razvoj i raznolikost bakterijskih zajednica. Ostale hipoteze (H2-H5) ispitane su primjenom dubokog sekvenciranja metagenoma umjetnih tala čiji je mineralni sastav najviše utjecao na raznolikost bakterijskih zajednica (MT i IL) nakon 842 dana inkubacije. Obzirom da je izvor hranjiva u obliku sterilnog stajskog gnoja zadnji put unesen prije više od 300 dana, u MT i IL detektirane su niske koncentracije organskog ugljika, ukupnog dušika i fosfora, te vrlo niski stehiometrijski omjeri C:N, C:P i N:P, što ukazuje na nedostatak ugljika, dušika i fosfora u ispitivanim umjetnim tlima koja je usporediva s drugim oligotrofnim ekosustavima. Ovi rezultati ukazuju da su lako dostupna hranjiva potrošena te da su u MT i IL najvjerojatnije zaostali samo teško razgradivi spojevi kao potencijalan izvor makronutrijenata, što potvrđuje hipotezu (H2). Zbog nedostupnosti lako razgradivih C spojeva, mikroorganizmi u MT i IL iskorištavaju teško razgradive C spojeve i mikrobne ostatke. Točnije, u MT mikroorganizmi, primarno koriste celulozu (bglX, bglB) i hitin (nagZ, hexA-B, hex), a u IL škrob (amyA) i hitin (CHIT1) kao izvore C. Iako niska zastupljenost gena koji kodiraju enzime uključene u fiksaciju ugljika nije ukazivala na dodatne izvore ugljika, detektirane mikrobnih grupe, točnije članovi koljena Cyanobacteria ukazuju da dio ugljika dospijeva u MT i IL i fiksacijom. Navedeno potvrđuje hipotezu (H3) da mikroorganizmi koriste različite mehanizme kako bi nadvladali depleciju ugljika u MT, odnosno IL. Slično kao kod kruženja C, rezultati su pokazali da su mikroorganizmi u MT i IL nadvladali nedostatak lako dostupnih dušičnih spojeva primarno depolimerizacijom, odnosno mineralizacijom složenih organskih N spojeva i mikrobnih ostataka. U MT detektirana je veća zastupljenost gena koji kodiraju ekstracelularne proteaze koje sudjeluju u depolimerizaciji/mineralizaciji dušika i razgradnji bakterijskih staničnih stijenki i proteina (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB), asimilaciji (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2) i usvajanju dušika (nrtP). S druge strane, u IL je detektirana veća zastupljenost gena uključenih u hitinolizu (CHIT1), denitrifikaciju (narH) i nitrifikaciju (amoC, hao), što ukazuje da je nedostatak dušika u tlu s IL, za razliku od tla s MT, potencijalno prevladan učinkovitijom potrošnjom alternativnih izvora dušika, kao što je hitin (CHIT1). Nadalje, nedostatak lako dostupnih P spojeva mikroorganizmi u MT su nadvladali pojačanim iskorištavanjem unutarstaničnih poli-P (ppa, ppx) rezervi i povećanjem učinkovitosti unosa fosfora u mikrobne stanice (pstSCAB). S druge strane, drukčiji adaptacijski mehanizmi detektirani su u IL, a uključuju pojačano iskorištavanje organskih P oblika pomoću alkalnih fosfataza (kodirane genima phoA i phoD) i glicerofosforil diester fosfodiesteraze (kodirana genom ugpQ) i efikasan transportni sustav glicerol-3-fosfata (ugpBAEC), što potvrđuje hipotezu (H4). Konačno, mikrobne grupe koje pokreću kruženje ugljika, dušika i fosfora u MT i IL prvenstveno spadaju u visoko zastupljene taksone koji su pronađeni u oba tla, dok je brojnost specijaliziranih mikrobnih grupa specifičnih za MT ili IL iznimno niska, što potvrđuje hipotezu (H5). Ovo istraživanje značajno je pridonijelo razumijevanju učinka minerala glina na uspostavljanje mikrobnih zajednica, identifikaciji funkcionalne mikrobiote koja pokreće kruženje hranjivih tvari i identifikaciji adaptacijskih mehanizama koje mikroorganizmi koriste za prevladavanju nedostatka C, N i P u ranim fazama razvoja tla. U tu svrhu, umjetna tla s točno definiranim karakteristikama su se pokazala kao nezamjenjiv alat koji omogućava istraživanje učinka isključivo jednog određenog parametra, u ovom slučaju, minerala gline. Konačno, metagenomsko sekvenciranje nove generacije trenutno predstavlja jedan od najboljih i sveobuhvatnih pristupa koji istovremeno omogućava istraživanje mikrobne raznolikosti, mikrobnih procesa, kao i povezivanje mikrobnih procesa s točno određenim mikrobnim taksonomskim grupama

Utjecaj minerala glina na uspostavu mikrobnih zajednica koje pokreću kruženje nutrijenata u ranim fazama razvoja tla

Soil is an integral part of every terrestrial ecosystem where it facilitates various ecosystem processes, including nutrient cycling (carbon (C), nitrogen (N)), and turnover (phosphorus (P)). The interaction between soil microbiota and soil constituents, such as clay minerals and organic matter leads to the formation of hotspots of microbial diversity and activity. Moreover, microbial metabolism actively shapes the habitat in which they live and influences soil formation together with other physical, chemical, and biological factors. Soil formation is a lengthy process based on the interaction of complex physical, chemical, and biological processes where microorganisms play an essential role as they drive nutrient availability and nutrient storage mainly if no plants are available. Furthermore, microbial diversity and function in the soil are affected by various abiotic and biotic factors, including mineral composition, and clay minerals in particular. Even though it was shown that different minerals can support and select different microorganisms, thus shaping the microbial community and function in soils, it is unknown how clay minerals influence the establishment, diversity, and adaptation of functional microbiota involved in nutrient cycling and turnover in the early stages of soil development. Therefore, this research aimed to improve our understanding of how clay minerals impact the establishment and diversity of microbial communities driving C, N, and P turnover during the early stages of soil development by combined analyses of the bacterial abundance and diversity with qPCR and T-RFLP respectively, and an in-depth analyses of microbial diversity and functional genes involved in C and N cycling, and P turnover based on a metagenomic shotgun sequencing of artificial soil microbiota. This study using artificial soils of different mineralogy (montmorillonite (MT), illite (IL), montmorillonite+charcoal (MT+CH), and illite+ferrihydrite (IL+FH)) has shown that soil properties, clay mineral composition in particular, strongly influence the establishment of different microbial communities during soil development. However, only two clay minerals (MT and IL) with different specific surface areas and charges that influence the nutrient availability, showed a strong effect on the bacterial community structure and function over the long-term incubation. Similar values of total organic C (13.5 ± 0.9 in MT and 11.6 ± 0.7 in IL), total N (1.5 ± 0.1 in MT and 1.3 ± 0.2 in IL), and total P (396 ± 20 in MT and 384 ± 29 in IL) content were detected in both soils. Consequently, the C:N:P ratios were very similar as well (82:7:1 in MT and 90:11:1 in IL) indicating C, N and P depleted system. However, based on the analysis of genes present in both soils, it is obvious that microorganisms have developed different strategies to overcome nutrient depletion in MT and IL. The degradation of recalcitrant C compounds such as cellulose (bglX, bglB) and chitin (nagZ, hexA-B, hex), N depolymerisation, and mineralization (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB) and assimilation (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2), together with effective P uptake and use of the internal poly-P pool (ppa, ppx, pstSCAB) were characteristic for MT. In contrast, starch (amyA) and chitin (chiA, CHIT1) were preferable C sources in IL. Furthermore, the higher abundance of denitrification related genes (narG, nirS, nifH) in IL indicates that N depletion was potentially overcome by the more efficient consumption of alternative N sources, such as chitin (chiA, CHIT1) when compared to MT. Lastly, higher abundances of genes encoding alkaline phosphatases (phoA, phoD), glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (ugpQ), and glycerol-3-phosphate transporter system (ugpBAEC) indicate that IL microbiota utilizes organic P sources to overcome P depletion. Overall, the results of this study significantly contribute to better understand the effect of clay minerals on the establishment of microbial communities that drive nutrient turnover, revealing different microbial strategies in adapting to and overcoming nutrient depletion during the early phases of soil development.Tlo je heterogena smjesa različitih mineralnih, organskih i bioloških komponenti i kao takvo predstavlja jedno od najsloženijih staništa u kojem mikroorganizmi obitavaju. Interakcije između mikroorganizama i čvrste faze tla, kao što su minerali glina i organska tvar uzrokuju stvaranje reaktivnih ploha koje predstavljaju žarišta mikrobne raznolikosti i aktivnosti. Sama veličina i fizikalno-kemijska svojstva ovakvih mikrostaništa ovise o izvornom matičnom supstratu. Među abiotičkim čimbenicima koji utječu na karakteristike mikrostaništa, ističe se mineralni sastav tla, točnije minerali glina. Dokazano je da minerali glina utječu na biogeokemijsko kruženje i mobilizaciju hranjivih tvari, kao što su ugljik (C), dušik (N) i fosfor (P). Prisutni su u svim tlima i sedimentima gdje tvore glavnu frakciju koja utječe na veličinu specifičnih reaktivnih površina. Smatraju se regulatorima kationske izmjene i mjestom adsorpcije organskih i anorganskih spojeva, čime utječu na dostupnost hranjivih tvari te posljedično na preživljavanje, metabolizam i funkciju mikroorganizama. Stoga, različiti mikroorganizmi naseljavaju tla s različitim mineralnim sastavom. Mikroorganizmi svojim metabolizmom aktivno mijenjaju stanište u kojem obitavaju te utječu na razvoj tla zajedno s ostalim biološkim, fizikalnim i kemijskim čimbenicima. Istovremeno, mikroorganizmi imaju središnju ulogu u biogeokemijskom kruženju svih kemijskih elemenata, među kojima se ugljik, dušik i fosfor smatraju esencijalnima. Njihova uloga u kruženju kemijskih elemenata je od posebnog značaja u ranim fazama razvoja tla. Obzirom da ugljik i dušik ne nalazimo u izvornom matičnom supstratu, potencijalni izvori ugljika i dušika u tlu uključuju taloženje organskih tvari i fiksaciju ugljika odnosno dušika od strane autotrofnih mikroorganizama. Fosfor, s druge strane, je prisutan u ranim fazama razvoja tla, prvenstveno u anorganskom obliku kao sastavni dio matičnog supstrata, te stoga njegova mobilizacija ovisi isključivo o mineralnom trošenju supstrata koje pak ovisi o aktivnosti i sposobnosti otapanja i mineralizacije od strane mikroorganizama. Međutim, još uvijek se ne zna u kojoj mjeri minerali glina utječu na sastav, razvoj i adaptaciju mikrobiote uključene u kruženje makronutrijenata u ranim fazama razvoja tla, zatim koje funkcionalne mikrobne grupe pokreću kruženje tvari u osiromašenim ekosustavima te koje procese i mehanizme koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Na temelju navedenog postavljene su sljedeće hipoteze: u umjetnim tlima različitog mineralnog sastava razvit će se različite mikrobne zajednice (H1), produžena inkubacija umjetnih tala dovest će do iscrpljenja bioraspoloživih oblika ugljika, dušika i fosfora i postupne prilagodbe i razvoja mikrobnih zajednica sposobnih iskorištavati teško dostupne oblike C, N i P (H2), nedostatak bioraspoloživog ugljika uzrokovat će adaptaciju mikrobnih gena uključenih u kruženje ugljika (H3), mikrorganizmi će nadvladati nedostatak bioraspoloživog N i P recikliranjem organskog N i P i efikasnijim unosom N i P u mikrobne stanice (H4) i konačno, funkcionalna mikrobiota sastojat će se primarno od tzv. generalista odnosno mikrobnih grupa prilagođenih širokom spektru ekoloških čimbenika sa sposobnošću iskorištavanja različitih izvora hranjiva među kojima će samo nekoliko grupa pokretati sve procese uključene u kruženje C, N i P, dok će zastupljenost specijalista tj. uskospecijaliziranih mikrobnih grupa koje pokreću neki specifičan proces u kruženju C, N i P biti će zanemariva (H5). Stoga, ciljevi ovog rada su ispitati utjecaj minerala glina na uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica, identificirati procese i mikrobne grupe koje pokreću kruženje makronutrijenata tijekom ranih faza razvoja tla i identificirati mehanizme koje mikroorganizmi koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Za ispitivanje postavljenih hipoteza korištena su dva pristupa. Utjecaj minerala glina na dostupnost hranjivih tvari, bakterijsku brojnost te uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica (H1) ispitan je u preliminarnom eksperimentu u kojem su pripremljena umjetna tla (n=4) koja se međusobno razlikuju po sastavu minerala gline. Ova tla su, uz kvarcni pijesak i prah, sadržavala jednu od sljedećih komponenti koje se često pojavljuju u prirodi: monmorilonit (MT), ilit (IL), montmorilonit+drveni ugljen (MT+CH) ili ilit+ferihidrit (IL+FH). Za svako umjetno tlo pripremljeno je 9 nezavisnih ponavljanja, mase do 500 g. Na početku eksperimenta, svako je umjetno tlo inokulirano mikrobnim inokulatom koji potječe od Ap horizonta prirodnog luvisola i sterilnim stajskim gnojem. Sterilni stajski gnoj je ponovno dodan svim umjetnim tlima 562. dan inkubacije. Inkubacija umjetnih tala završena je nakon 842 dana. Pretpostavljano je da će se do ovog trenutka, ovisno o tipu minerala glina, formirati mikro- i makro-agregati usporedivi onima u prirodnim tlima. Ovako pripremljenim umjetnim tlima potom je dodan biljni materijal u triplikatima. Kako bi se provjerilo da li su umjetna tla usporediva s prirodnim tlom, jedan uzorak luvisola (Scheyern) je u triplikatima tretiran biljnim materijalom. Istovremeno, pripremljene su i kontrole koje su se od umjetnih tala i luvisola razlikovale samo po tome što im nije dodan biljni materijal. Sva tla su dodatno inkubirana tijekom 63 dana u mraku, uz održavanje stalne vlage. Uzorci su uzeti 0., 7., 21. i 63. dan nakon dodavanja biljnog materijala. Utjecaj minerala gline na dostupnost ugljikovih spojeva i aktivnost mikroorganizama određena je na temelju WEOC (organski C koji se može ekstrahirati vodom) vrijednosti, brojnost na temelju Cmic vrijednosti i kvantifikacijom 16S rRNA gena, a raznolikost bakterijskih zajednica na temelju T-RFLP analize 16S rRNA gena amplificiranog početnicama 6-FAM-27f i 1401r. Primijećeno je da u svim umjetnim tlima, bez obzira na prisutne minerale gline, WEOC vrijednosti opadaju odmah nakon dodatka biljnog materijala, što se može objasniti povećanom mikrobnom aktivnošću i trenutnim iskorištavanjem lako dostupnog ugljika od strane mikroorganizma. Iako je isti trend zamijećen u svim umjetnim tlima, nešto niže WEOC vrijednosti su detektirane u umjetnim tlima koja sadrže MT u usporedbi s tlima koja sadrže IL, što ukazuje na bržu izmjenu hranjivih tvari u MT, kao i nešto višom stopom mikrobne respiracije. U prirodnom tlu, s druge strane, opadanje WEOC vrijednosti je detektirano tek kasnije tijekom inkubacije, u usporedbi s umjetnim tlima, što se može pripisati bolje razvijenim strukturama u prirodnom tlu i organskoj tvari koje bolje i brže vežu raspoložive ugljikove spojeve te ih na taj način privremeno štite od mikrobnog djelovanja. U svim umjetnim tlima, kao i u prirodnom tlu tretiranim biljnim materijalom, mikrobna biomasa se povećala od 0. do 7. dana inkubacije, što je vidljivo iz porasta Cmic vrijednosti, i u skladu je s dinamikom WEOC vrijednosti. Bakterijska brojnost, kao što je vidljivo iz broja 16S rRNA kopija gena g-1 suhe tvari tla, povećava se u MT, MT+CH i IL+FH umjetnim tlima tek kasnije tijekom inkubacije. Iako su i Cmic i broj kopija gena 16S rRNA odraz mikrobne biomase, nesklad između rezultata može se pripisati metodološkim razlikama. Obzirom da je u svim umjetnim tlima detektiran sličan trend u kretanju WEOC i Cmic vrijednosti te broju 16S rRNA gena, nije bilo moguće potvrditi H1 hipotezu isključivo na temelju tih parametara. Konačno, na temelju PCA analize T-RF fragmenata 16S rRNA gena, vidljivo je da se bakterijske zajednice u umjetnim tlima značajno razlikuju od bakterijskih zajednica u luvisolu. Nadalje, iz ovih rezultata je vidljivo da na uspostavu i razvoj bakterijskih zajednica u umjetnim tlima najviše utječu minerali gline MT i IL, što se može objasniti razlikama u fizikalno-kemijskim karakteristikama, prvenstveno razlikama u specifičnoj površini i naboju minerala gline, što pak utječe na dostupnost hranjivih tvari mikroorganizmima. Stoga, ovi rezultati potvrđuju hipotezu (H1) da određene grupe mikroorganizama preferiraju određene tipove minerala gline, te da posljedično prisutnost minerala gline u tlu utječe na uspostavu, razvoj i raznolikost bakterijskih zajednica. Ostale hipoteze (H2-H5) ispitane su primjenom dubokog sekvenciranja metagenoma umjetnih tala čiji je mineralni sastav najviše utjecao na raznolikost bakterijskih zajednica (MT i IL) nakon 842 dana inkubacije. Obzirom da je izvor hranjiva u obliku sterilnog stajskog gnoja zadnji put unesen prije više od 300 dana, u MT i IL detektirane su niske koncentracije organskog ugljika, ukupnog dušika i fosfora, te vrlo niski stehiometrijski omjeri C:N, C:P i N:P, što ukazuje na nedostatak ugljika, dušika i fosfora u ispitivanim umjetnim tlima koja je usporediva s drugim oligotrofnim ekosustavima. Ovi rezultati ukazuju da su lako dostupna hranjiva potrošena te da su u MT i IL najvjerojatnije zaostali samo teško razgradivi spojevi kao potencijalan izvor makronutrijenata, što potvrđuje hipotezu (H2). Zbog nedostupnosti lako razgradivih C spojeva, mikroorganizmi u MT i IL iskorištavaju teško razgradive C spojeve i mikrobne ostatke. Točnije, u MT mikroorganizmi, primarno koriste celulozu (bglX, bglB) i hitin (nagZ, hexA-B, hex), a u IL škrob (amyA) i hitin (CHIT1) kao izvore C. Iako niska zastupljenost gena koji kodiraju enzime uključene u fiksaciju ugljika nije ukazivala na dodatne izvore ugljika, detektirane mikrobnih grupe, točnije članovi koljena Cyanobacteria ukazuju da dio ugljika dospijeva u MT i IL i fiksacijom. Navedeno potvrđuje hipotezu (H3) da mikroorganizmi koriste različite mehanizme kako bi nadvladali depleciju ugljika u MT, odnosno IL. Slično kao kod kruženja C, rezultati su pokazali da su mikroorganizmi u MT i IL nadvladali nedostatak lako dostupnih dušičnih spojeva primarno depolimerizacijom, odnosno mineralizacijom složenih organskih N spojeva i mikrobnih ostataka. U MT detektirana je veća zastupljenost gena koji kodiraju ekstracelularne proteaze koje sudjeluju u depolimerizaciji/mineralizaciji dušika i razgradnji bakterijskih staničnih stijenki i proteina (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB), asimilaciji (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2) i usvajanju dušika (nrtP). S druge strane, u IL je detektirana veća zastupljenost gena uključenih u hitinolizu (CHIT1), denitrifikaciju (narH) i nitrifikaciju (amoC, hao), što ukazuje da je nedostatak dušika u tlu s IL, za razliku od tla s MT, potencijalno prevladan učinkovitijom potrošnjom alternativnih izvora dušika, kao što je hitin (CHIT1). Nadalje, nedostatak lako dostupnih P spojeva mikroorganizmi u MT su nadvladali pojačanim iskorištavanjem unutarstaničnih poli-P (ppa, ppx) rezervi i povećanjem učinkovitosti unosa fosfora u mikrobne stanice (pstSCAB). S druge strane, drukčiji adaptacijski mehanizmi detektirani su u IL, a uključuju pojačano iskorištavanje organskih P oblika pomoću alkalnih fosfataza (kodirane genima phoA i phoD) i glicerofosforil diester fosfodiesteraze (kodirana genom ugpQ) i efikasan transportni sustav glicerol-3-fosfata (ugpBAEC), što potvrđuje hipotezu (H4). Konačno, mikrobne grupe koje pokreću kruženje ugljika, dušika i fosfora u MT i IL prvenstveno spadaju u visoko zastupljene taksone koji su pronađeni u oba tla, dok je brojnost specijaliziranih mikrobnih grupa specifičnih za MT ili IL iznimno niska, što potvrđuje hipotezu (H5). Ovo istraživanje značajno je pridonijelo razumijevanju učinka minerala glina na uspostavljanje mikrobnih zajednica, identifikaciji funkcionalne mikrobiote koja pokreće kruženje hranjivih tvari i identifikaciji adaptacijskih mehanizama koje mikroorganizmi koriste za prevladavanju nedostatka C, N i P u ranim fazama razvoja tla. U tu svrhu, umjetna tla s točno definiranim karakteristikama su se pokazala kao nezamjenjiv alat koji omogućava istraživanje učinka isključivo jednog određenog parametra, u ovom slučaju, minerala gline. Konačno, metagenomsko sekvenciranje nove generacije trenutno predstavlja jedan od najboljih i sveobuhvatnih pristupa koji istovremeno omogućava istraživanje mikrobne raznolikosti, mikrobnih procesa, kao i povezivanje mikrobnih procesa s točno određenim mikrobnim taksonomskim grupama

Metric and Spectral Insight into Bee-Pollen-to-Bee-Bread Transformation Process

Due to numerous bioactive constituents, both bee pollen (BP) and bee bread (BB) represent valuable food supplements. The transformation of BP into BB is a complex biochemical in-hive process that enables the preservation of the pollen’s nutritional value. The aim of this study was to determine the depth of the honeycomb cells in which bees store pollen and to provide a spectral insight into the chemical changes that occur during the BP-to-BB transformation process. This study was carried out on three experimental colonies of Apis mellifera carnica, from which fresh BP was collected using pollen traps, while BB samples were manually extracted from the cells two weeks after BP sampling. The samples were analyzed using infrared (FTIR-ATR) spectroscopy, and the depth of the cells was measured using a caliper. The results showed that the average depth of the cells was 11.0 mm, and that the bees stored BB up to an average of 7.85 mm, thus covering between ⅔ and ¾ (71.4%) of the cell. The FTIR-ATR analysis revealed unique spectral profiles of both BP and BB, indicating compositional changes primarily reflected in a higher water content and an altered composition of the carbohydrate fraction (and, to a lesser extent, the lipid fraction) in BB compared to BP