Utjecaj minerala glina na uspostavu mikrobnih zajednica koje pokreću kruženje nutrijenata u ranim fazama razvoja tla

Abstract

Soil is an integral part of every terrestrial ecosystem where it facilitates various ecosystem processes, including nutrient cycling (carbon (C), nitrogen (N)), and turnover (phosphorus (P)). The interaction between soil microbiota and soil constituents, such as clay minerals and organic matter leads to the formation of hotspots of microbial diversity and activity. Moreover, microbial metabolism actively shapes the habitat in which they live and influences soil formation together with other physical, chemical, and biological factors. Soil formation is a lengthy process based on the interaction of complex physical, chemical, and biological processes where microorganisms play an essential role as they drive nutrient availability and nutrient storage mainly if no plants are available. Furthermore, microbial diversity and function in the soil are affected by various abiotic and biotic factors, including mineral composition, and clay minerals in particular. Even though it was shown that different minerals can support and select different microorganisms, thus shaping the microbial community and function in soils, it is unknown how clay minerals influence the establishment, diversity, and adaptation of functional microbiota involved in nutrient cycling and turnover in the early stages of soil development. Therefore, this research aimed to improve our understanding of how clay minerals impact the establishment and diversity of microbial communities driving C, N, and P turnover during the early stages of soil development by combined analyses of the bacterial abundance and diversity with qPCR and T-RFLP respectively, and an in-depth analyses of microbial diversity and functional genes involved in C and N cycling, and P turnover based on a metagenomic shotgun sequencing of artificial soil microbiota. This study using artificial soils of different mineralogy (montmorillonite (MT), illite (IL), montmorillonite+charcoal (MT+CH), and illite+ferrihydrite (IL+FH)) has shown that soil properties, clay mineral composition in particular, strongly influence the establishment of different microbial communities during soil development. However, only two clay minerals (MT and IL) with different specific surface areas and charges that influence the nutrient availability, showed a strong effect on the bacterial community structure and function over the long-term incubation. Similar values of total organic C (13.5 ± 0.9 in MT and 11.6 ± 0.7 in IL), total N (1.5 ± 0.1 in MT and 1.3 ± 0.2 in IL), and total P (396 ± 20 in MT and 384 ± 29 in IL) content were detected in both soils. Consequently, the C:N:P ratios were very similar as well (82:7:1 in MT and 90:11:1 in IL) indicating C, N and P depleted system. However, based on the analysis of genes present in both soils, it is obvious that microorganisms have developed different strategies to overcome nutrient depletion in MT and IL. The degradation of recalcitrant C compounds such as cellulose (bglX, bglB) and chitin (nagZ, hexA-B, hex), N depolymerisation, and mineralization (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB) and assimilation (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2), together with effective P uptake and use of the internal poly-P pool (ppa, ppx, pstSCAB) were characteristic for MT. In contrast, starch (amyA) and chitin (chiA, CHIT1) were preferable C sources in IL. Furthermore, the higher abundance of denitrification related genes (narG, nirS, nifH) in IL indicates that N depletion was potentially overcome by the more efficient consumption of alternative N sources, such as chitin (chiA, CHIT1) when compared to MT. Lastly, higher abundances of genes encoding alkaline phosphatases (phoA, phoD), glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (ugpQ), and glycerol-3-phosphate transporter system (ugpBAEC) indicate that IL microbiota utilizes organic P sources to overcome P depletion. Overall, the results of this study significantly contribute to better understand the effect of clay minerals on the establishment of microbial communities that drive nutrient turnover, revealing different microbial strategies in adapting to and overcoming nutrient depletion during the early phases of soil development.Tlo je heterogena smjesa različitih mineralnih, organskih i bioloških komponenti i kao takvo predstavlja jedno od najsloženijih staništa u kojem mikroorganizmi obitavaju. Interakcije između mikroorganizama i čvrste faze tla, kao što su minerali glina i organska tvar uzrokuju stvaranje reaktivnih ploha koje predstavljaju žarišta mikrobne raznolikosti i aktivnosti. Sama veličina i fizikalno-kemijska svojstva ovakvih mikrostaništa ovise o izvornom matičnom supstratu. Među abiotičkim čimbenicima koji utječu na karakteristike mikrostaništa, ističe se mineralni sastav tla, točnije minerali glina. Dokazano je da minerali glina utječu na biogeokemijsko kruženje i mobilizaciju hranjivih tvari, kao što su ugljik (C), dušik (N) i fosfor (P). Prisutni su u svim tlima i sedimentima gdje tvore glavnu frakciju koja utječe na veličinu specifičnih reaktivnih površina. Smatraju se regulatorima kationske izmjene i mjestom adsorpcije organskih i anorganskih spojeva, čime utječu na dostupnost hranjivih tvari te posljedično na preživljavanje, metabolizam i funkciju mikroorganizama. Stoga, različiti mikroorganizmi naseljavaju tla s različitim mineralnim sastavom. Mikroorganizmi svojim metabolizmom aktivno mijenjaju stanište u kojem obitavaju te utječu na razvoj tla zajedno s ostalim biološkim, fizikalnim i kemijskim čimbenicima. Istovremeno, mikroorganizmi imaju središnju ulogu u biogeokemijskom kruženju svih kemijskih elemenata, među kojima se ugljik, dušik i fosfor smatraju esencijalnima. Njihova uloga u kruženju kemijskih elemenata je od posebnog značaja u ranim fazama razvoja tla. Obzirom da ugljik i dušik ne nalazimo u izvornom matičnom supstratu, potencijalni izvori ugljika i dušika u tlu uključuju taloženje organskih tvari i fiksaciju ugljika odnosno dušika od strane autotrofnih mikroorganizama. Fosfor, s druge strane, je prisutan u ranim fazama razvoja tla, prvenstveno u anorganskom obliku kao sastavni dio matičnog supstrata, te stoga njegova mobilizacija ovisi isključivo o mineralnom trošenju supstrata koje pak ovisi o aktivnosti i sposobnosti otapanja i mineralizacije od strane mikroorganizama. Međutim, još uvijek se ne zna u kojoj mjeri minerali glina utječu na sastav, razvoj i adaptaciju mikrobiote uključene u kruženje makronutrijenata u ranim fazama razvoja tla, zatim koje funkcionalne mikrobne grupe pokreću kruženje tvari u osiromašenim ekosustavima te koje procese i mehanizme koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Na temelju navedenog postavljene su sljedeće hipoteze: u umjetnim tlima različitog mineralnog sastava razvit će se različite mikrobne zajednice (H1), produžena inkubacija umjetnih tala dovest će do iscrpljenja bioraspoloživih oblika ugljika, dušika i fosfora i postupne prilagodbe i razvoja mikrobnih zajednica sposobnih iskorištavati teško dostupne oblike C, N i P (H2), nedostatak bioraspoloživog ugljika uzrokovat će adaptaciju mikrobnih gena uključenih u kruženje ugljika (H3), mikrorganizmi će nadvladati nedostatak bioraspoloživog N i P recikliranjem organskog N i P i efikasnijim unosom N i P u mikrobne stanice (H4) i konačno, funkcionalna mikrobiota sastojat će se primarno od tzv. generalista odnosno mikrobnih grupa prilagođenih širokom spektru ekoloških čimbenika sa sposobnošću iskorištavanja različitih izvora hranjiva među kojima će samo nekoliko grupa pokretati sve procese uključene u kruženje C, N i P, dok će zastupljenost specijalista tj. uskospecijaliziranih mikrobnih grupa koje pokreću neki specifičan proces u kruženju C, N i P biti će zanemariva (H5). Stoga, ciljevi ovog rada su ispitati utjecaj minerala glina na uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica, identificirati procese i mikrobne grupe koje pokreću kruženje makronutrijenata tijekom ranih faza razvoja tla i identificirati mehanizme koje mikroorganizmi koriste da nadvladaju nedostatak C, N i P tijekom produžene inkubacije tala. Za ispitivanje postavljenih hipoteza korištena su dva pristupa. Utjecaj minerala glina na dostupnost hranjivih tvari, bakterijsku brojnost te uspostavu, raznolikost i aktivnost mikrobnih zajednica (H1) ispitan je u preliminarnom eksperimentu u kojem su pripremljena umjetna tla (n=4) koja se međusobno razlikuju po sastavu minerala gline. Ova tla su, uz kvarcni pijesak i prah, sadržavala jednu od sljedećih komponenti koje se često pojavljuju u prirodi: monmorilonit (MT), ilit (IL), montmorilonit+drveni ugljen (MT+CH) ili ilit+ferihidrit (IL+FH). Za svako umjetno tlo pripremljeno je 9 nezavisnih ponavljanja, mase do 500 g. Na početku eksperimenta, svako je umjetno tlo inokulirano mikrobnim inokulatom koji potječe od Ap horizonta prirodnog luvisola i sterilnim stajskim gnojem. Sterilni stajski gnoj je ponovno dodan svim umjetnim tlima 562. dan inkubacije. Inkubacija umjetnih tala završena je nakon 842 dana. Pretpostavljano je da će se do ovog trenutka, ovisno o tipu minerala glina, formirati mikro- i makro-agregati usporedivi onima u prirodnim tlima. Ovako pripremljenim umjetnim tlima potom je dodan biljni materijal u triplikatima. Kako bi se provjerilo da li su umjetna tla usporediva s prirodnim tlom, jedan uzorak luvisola (Scheyern) je u triplikatima tretiran biljnim materijalom. Istovremeno, pripremljene su i kontrole koje su se od umjetnih tala i luvisola razlikovale samo po tome što im nije dodan biljni materijal. Sva tla su dodatno inkubirana tijekom 63 dana u mraku, uz održavanje stalne vlage. Uzorci su uzeti 0., 7., 21. i 63. dan nakon dodavanja biljnog materijala. Utjecaj minerala gline na dostupnost ugljikovih spojeva i aktivnost mikroorganizama određena je na temelju WEOC (organski C koji se može ekstrahirati vodom) vrijednosti, brojnost na temelju Cmic vrijednosti i kvantifikacijom 16S rRNA gena, a raznolikost bakterijskih zajednica na temelju T-RFLP analize 16S rRNA gena amplificiranog početnicama 6-FAM-27f i 1401r. Primijećeno je da u svim umjetnim tlima, bez obzira na prisutne minerale gline, WEOC vrijednosti opadaju odmah nakon dodatka biljnog materijala, što se može objasniti povećanom mikrobnom aktivnošću i trenutnim iskorištavanjem lako dostupnog ugljika od strane mikroorganizma. Iako je isti trend zamijećen u svim umjetnim tlima, nešto niže WEOC vrijednosti su detektirane u umjetnim tlima koja sadrže MT u usporedbi s tlima koja sadrže IL, što ukazuje na bržu izmjenu hranjivih tvari u MT, kao i nešto višom stopom mikrobne respiracije. U prirodnom tlu, s druge strane, opadanje WEOC vrijednosti je detektirano tek kasnije tijekom inkubacije, u usporedbi s umjetnim tlima, što se može pripisati bolje razvijenim strukturama u prirodnom tlu i organskoj tvari koje bolje i brže vežu raspoložive ugljikove spojeve te ih na taj način privremeno štite od mikrobnog djelovanja. U svim umjetnim tlima, kao i u prirodnom tlu tretiranim biljnim materijalom, mikrobna biomasa se povećala od 0. do 7. dana inkubacije, što je vidljivo iz porasta Cmic vrijednosti, i u skladu je s dinamikom WEOC vrijednosti. Bakterijska brojnost, kao što je vidljivo iz broja 16S rRNA kopija gena g-1 suhe tvari tla, povećava se u MT, MT+CH i IL+FH umjetnim tlima tek kasnije tijekom inkubacije. Iako su i Cmic i broj kopija gena 16S rRNA odraz mikrobne biomase, nesklad između rezultata može se pripisati metodološkim razlikama. Obzirom da je u svim umjetnim tlima detektiran sličan trend u kretanju WEOC i Cmic vrijednosti te broju 16S rRNA gena, nije bilo moguće potvrditi H1 hipotezu isključivo na temelju tih parametara. Konačno, na temelju PCA analize T-RF fragmenata 16S rRNA gena, vidljivo je da se bakterijske zajednice u umjetnim tlima značajno razlikuju od bakterijskih zajednica u luvisolu. Nadalje, iz ovih rezultata je vidljivo da na uspostavu i razvoj bakterijskih zajednica u umjetnim tlima najviše utječu minerali gline MT i IL, što se može objasniti razlikama u fizikalno-kemijskim karakteristikama, prvenstveno razlikama u specifičnoj površini i naboju minerala gline, što pak utječe na dostupnost hranjivih tvari mikroorganizmima. Stoga, ovi rezultati potvrđuju hipotezu (H1) da određene grupe mikroorganizama preferiraju određene tipove minerala gline, te da posljedično prisutnost minerala gline u tlu utječe na uspostavu, razvoj i raznolikost bakterijskih zajednica. Ostale hipoteze (H2-H5) ispitane su primjenom dubokog sekvenciranja metagenoma umjetnih tala čiji je mineralni sastav najviše utjecao na raznolikost bakterijskih zajednica (MT i IL) nakon 842 dana inkubacije. Obzirom da je izvor hranjiva u obliku sterilnog stajskog gnoja zadnji put unesen prije više od 300 dana, u MT i IL detektirane su niske koncentracije organskog ugljika, ukupnog dušika i fosfora, te vrlo niski stehiometrijski omjeri C:N, C:P i N:P, što ukazuje na nedostatak ugljika, dušika i fosfora u ispitivanim umjetnim tlima koja je usporediva s drugim oligotrofnim ekosustavima. Ovi rezultati ukazuju da su lako dostupna hranjiva potrošena te da su u MT i IL najvjerojatnije zaostali samo teško razgradivi spojevi kao potencijalan izvor makronutrijenata, što potvrđuje hipotezu (H2). Zbog nedostupnosti lako razgradivih C spojeva, mikroorganizmi u MT i IL iskorištavaju teško razgradive C spojeve i mikrobne ostatke. Točnije, u MT mikroorganizmi, primarno koriste celulozu (bglX, bglB) i hitin (nagZ, hexA-B, hex), a u IL škrob (amyA) i hitin (CHIT1) kao izvore C. Iako niska zastupljenost gena koji kodiraju enzime uključene u fiksaciju ugljika nije ukazivala na dodatne izvore ugljika, detektirane mikrobnih grupe, točnije članovi koljena Cyanobacteria ukazuju da dio ugljika dospijeva u MT i IL i fiksacijom. Navedeno potvrđuje hipotezu (H3) da mikroorganizmi koriste različite mehanizme kako bi nadvladali depleciju ugljika u MT, odnosno IL. Slično kao kod kruženja C, rezultati su pokazali da su mikroorganizmi u MT i IL nadvladali nedostatak lako dostupnih dušičnih spojeva primarno depolimerizacijom, odnosno mineralizacijom složenih organskih N spojeva i mikrobnih ostataka. U MT detektirana je veća zastupljenost gena koji kodiraju ekstracelularne proteaze koje sudjeluju u depolimerizaciji/mineralizaciji dušika i razgradnji bakterijskih staničnih stijenki i proteina (pepA, pepN, pepD, pip, clpP, clpX, aguB, hmgL, hutH, CTH, sdaA/sdaB, dsdA, tdcB), asimilaciji (gudB/rocG, gdhA/GLUD1, gdhA/GLUD2) i usvajanju dušika (nrtP). S druge strane, u IL je detektirana veća zastupljenost gena uključenih u hitinolizu (CHIT1), denitrifikaciju (narH) i nitrifikaciju (amoC, hao), što ukazuje da je nedostatak dušika u tlu s IL, za razliku od tla s MT, potencijalno prevladan učinkovitijom potrošnjom alternativnih izvora dušika, kao što je hitin (CHIT1). Nadalje, nedostatak lako dostupnih P spojeva mikroorganizmi u MT su nadvladali pojačanim iskorištavanjem unutarstaničnih poli-P (ppa, ppx) rezervi i povećanjem učinkovitosti unosa fosfora u mikrobne stanice (pstSCAB). S druge strane, drukčiji adaptacijski mehanizmi detektirani su u IL, a uključuju pojačano iskorištavanje organskih P oblika pomoću alkalnih fosfataza (kodirane genima phoA i phoD) i glicerofosforil diester fosfodiesteraze (kodirana genom ugpQ) i efikasan transportni sustav glicerol-3-fosfata (ugpBAEC), što potvrđuje hipotezu (H4). Konačno, mikrobne grupe koje pokreću kruženje ugljika, dušika i fosfora u MT i IL prvenstveno spadaju u visoko zastupljene taksone koji su pronađeni u oba tla, dok je brojnost specijaliziranih mikrobnih grupa specifičnih za MT ili IL iznimno niska, što potvrđuje hipotezu (H5). Ovo istraživanje značajno je pridonijelo razumijevanju učinka minerala glina na uspostavljanje mikrobnih zajednica, identifikaciji funkcionalne mikrobiote koja pokreće kruženje hranjivih tvari i identifikaciji adaptacijskih mehanizama koje mikroorganizmi koriste za prevladavanju nedostatka C, N i P u ranim fazama razvoja tla. U tu svrhu, umjetna tla s točno definiranim karakteristikama su se pokazala kao nezamjenjiv alat koji omogućava istraživanje učinka isključivo jednog određenog parametra, u ovom slučaju, minerala gline. Konačno, metagenomsko sekvenciranje nove generacije trenutno predstavlja jedan od najboljih i sveobuhvatnih pristupa koji istovremeno omogućava istraživanje mikrobne raznolikosti, mikrobnih procesa, kao i povezivanje mikrobnih procesa s točno određenim mikrobnim taksonomskim grupama