Evaluierung der biologischen Sicherheit von Xenotransplantaten

Einleitung: Die im Genom der Schweine integrierten porzinen endogenen Retroviren (PERV) gehören zu den potentiellen humanpathogenen Erregern, die eines der Risiken bei der Xenotransplantation darstellen. Für die Abschätzung des Infektionsrisikos von PERV sind drei Verfahrensweisen von Bedeutung: Erstens die Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Zellen und Geweben; Zweitens die Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells und Drittens ein retrospektives Screenen von Patienten. Methoden: Die PERV-Expression in Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse wurde in vitro und in vivo evaluiert. Anschließend wurde PERV auf nicht-humanen Primatenzellen passagiert. In einem zweiten Modellversuch wurde murinen Zellen in vitro und SCID-Mäusen in vivo zellfreies PERV appliziert. Schließlich wurden Seren von Patienten analysiert. Ergebnisse: Die untersuchten Inselzellen setzten keine Viruspartikel frei und konnten somit weder humane Zellen noch BALB/c-Mäuse infizieren. Die verwendeten Affenzellen produzierten infektiöses PERV mit geringer Replikation. Weder in den murinen Modellversuchen noch in den untersuchten Patienten wurde eine Übertragung von PERV beobachtet. Schlussfolgerung: Schweine der Deutschen Landrasse könnten als Ausgangsbasis für die Zucht sicherer Schweine für die Xenotransplantation dienen. Da keine Infektion verschiedener muriner Zellen mit PERV beobachtet wurde, muss angenommen werden, dass Publikationen anderer Arbeitsgruppen, die eine PERV-Infektion in SCID-Mäusen diagnostizierten, ein falsch-positives Ergebnis aufgrund von Mikrochimärismus oder aufgrund von Pseudotypisierungen mit murinen endogenen Retroviren wiedergeben. Unsere Befunde werden dadurch erhärtet, dass der Rezeptor für PERV-A auf murinen Zellen nicht exprimiert wird und diese auch in vitro nicht infiziert werden konnten. In Übereinstimmung mit den weltweit etwa 200 behandelten Patienten konnte auch in den beiden neuen Studien keine Übertragung von PERV festgestellt werden.Objective: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are integrated in the porcine genome and are able to infect human cells in vitro. Therefore, PERVs are one of the possible pathogens which poses a risk for xenotransplantations. In this study three significant methods were used to evaluate the infectious risk of PERV: The release of PERV particles from porcine cells and tissues, the formation of an in vivo infection model and a retrospective screening of patients. Methods: Islet cells from german landrace pigs were co-cultivated with human cells in vitro and were transplanted in BALB/c mice in vivo. Serial passaging experiments were performed with nonhuman primate cells. Murine cells were incubated in vitro and SCID mice in vivo with PERV. Sera of patients who were treated ex vivo with porcine liver cells and who had received islet cells were investigated for antibodies against PERV. Results: No virus release were observed in german landrace islet cells, thus they were neither able to infect human cells nor BALB/c mice. The used nonhuman primate cells released low replicating PERVs. None of the murine cells could be infected by PERV and no provirus integration was observed in different SCID mice organs. PERV-specific antibodies were found in none of the investigated patients. Conclusion: German landrace pigs could be used as a source for breeding safe genetically modified pigs suitable for xenotransplantation. Since there were no detectable PERV infection of different murine cells and SCID mice, it have to be supposed, that previously reported PERV transmissions to SCID mice might be due to microchimerism or to pseudotyping of murine endogenous retroviruses. Our results were confirmed by the fact, that the receptor for PERV-A is not expressed on murine cells and that these cells could not be infected in vitro. The absence of a PERV transmission in the investigated patients, correspond to the results obtained from approximately twohundred treated patients worldwide

Evaluierung der biologischen Sicherheit von Xenotransplantaten: Untersuchungen zur Übertragung von porzinen endogenen Retroviren in vitro und in vivo

Einleitung: Die im Genom der Schweine integrierten porzinen endogenen Retroviren (PERV) gehören zu den potentiellen humanpathogenen Erregern, die eines der Risiken bei der Xenotransplantation darstellen. Für die Abschätzung des Infektionsrisikos von PERV sind drei Verfahrensweisen von Bedeutung: Erstens die Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Zellen und Geweben; Zweitens die Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells und Drittens ein retrospektives Screenen von Patienten. Methoden: Die PERV-Expression in Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse wurde in vitro und in vivo evaluiert. Anschließend wurde PERV auf nicht-humanen Primatenzellen passagiert. In einem zweiten Modellversuch wurde murinen Zellen in vitro und SCID-Mäusen in vivo zellfreies PERV appliziert. Schließlich wurden Seren von Patienten analysiert. Ergebnisse: Die untersuchten Inselzellen setzten keine Viruspartikel frei und konnten somit weder humane Zellen noch BALB/c-Mäuse infizieren. Die verwendeten Affenzellen produzierten infektiöses PERV mit geringer Replikation. Weder in den murinen Modellversuchen noch in den untersuchten Patienten wurde eine Übertragung von PERV beobachtet. Schlussfolgerung: Schweine der Deutschen Landrasse könnten als Ausgangsbasis für die Zucht sicherer Schweine für die Xenotransplantation dienen. Da keine Infektion verschiedener muriner Zellen mit PERV beobachtet wurde, muss angenommen werden, dass Publikationen anderer Arbeitsgruppen, die eine PERV-Infektion in SCID-Mäusen diagnostizierten, ein falsch-positives Ergebnis aufgrund von Mikrochimärismus oder aufgrund von Pseudotypisierungen mit murinen endogenen Retroviren wiedergeben. Unsere Befunde werden dadurch erhärtet, dass der Rezeptor für PERV-A auf murinen Zellen nicht exprimiert wird und diese auch in vitro nicht infiziert werden konnten. In Übereinstimmung mit den weltweit etwa 200 behandelten Patienten konnte auch in den beiden neuen Studien keine Übertragung von PERV festgestellt werden

Characterisation of a human cell-adapted porcine endogenous retrovirus PERV-A/C.

Background: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) pose a potential risk for xenotransplantation using pig cells, tissues or organs. A special threat comes from viruses generated by recombination between human-tropic PERV-A and ecotropic PERV-C. Serial passages of a recombinant PERV-A/C on human 293 cells resulted in increased infectious titers and a multimerization of transcription factor binding sites in the viral long terminal repeat (LTR). In contrast to the LTR, the sequence of the env gene did not change, indicating that the LTR represents the determinant of high infectivity. Material/Methods: The virus was further propagated on human cells and characterized by different methods (titration, sequencing, infection experiments, electron microscopy). Results: Further propagation on human 293 cells resulted in deletions and mutations in the LTR. In contrast to low-titer viruses, the high-titer virus was infectious for cells from non-human primates including chimpanzees. Scanning electron microscopy revealed clustering of budding virions at the cell surface of infected human cells and transmission electron microscopy indicated that the virus infects them via receptor-mediated endocytosis. Conclusions: After propagation of PERV on human cells without selection pressure, viruses with different LTR were generated. High titer PERV was shown to infect cells from non-human primates. The experiments performed here simulate the situation in vivo and give an extended characterization of human cell-adapted PERVs

Proteome dynamics and early salt stress response of the photosynthetic organism <it>Chlamydomonas reinhardtii</it>

Abstract Background The cellular proteome and metabolome are underlying dynamic regulation allowing rapid adaptation to changes in the environment. System-wide analysis of these dynamics will provide novel insights into mechanisms of stress adaptation for higher photosynthetic organisms. We applied pulsed-SILAC labeling to a photosynthetic organism for the first time and we established a method to study proteome dynamics in the green alga Chlamydomonas reinhardtii, an emerging model system for plant biology. In addition, we combined the analysis of protein synthesis with metabolic profiling to study the dynamic changes of metabolism and proteome turnover under salt stress conditions. Results To study de novo protein synthesis an arginine auxotroph Chlamydomonas strain was cultivated in presence of stable isotope-labeled arginine for 24 hours. From the time course experiment in 3 salt concentrations we could identify more than 2500 proteins and their H/L ratio in at least one experimental condition; for 998 protiens at least 3 ratio counts were detected in the 24 h time point (0 mM NaCl). After fractionation we could identify 3115 proteins and for 1765 of them we determined their de novo synthesis rate. Consistently with previous findings we showed that RuBisCO is among the most prominent proteins in the cell; and similar abundance and turnover for the small and large RuBisCO subunit could be calculated. The D1 protein was identified among proteins with a high synthesis rates. A global median half-life of 45 h was calculated for Chlamydomonas proteins under the chosen conditions. Conclusion To investigate the temporal co-regulation of the proteome and metabolome, we applied salt stress to Chlamydomonas and studied the time dependent regulation of protein expression and changes in the metabolome. The main metabolic response to salt stress was observed within the amino acid metabolism. In particular, proline was up-regulated manifold and according to that an increased carbon flow within the proline biosynthetic pathway could be measured. In parallel the analysis of abundance and de novo synthesis of the corresponding enzymes revealed that metabolic rearrangements precede adjustments of protein abundance.</p

Comparative Analysis of Transposable Element Vector Systems in Human Cells

Transposon-based gene vectors have become indispensable tools in vertebrate genetics for applications ranging from insertional mutagenesis and transgenesis in model species to gene therapy in humans. The transposon toolkit is expanding, but a careful, side-by-side characterization of the diverse transposon systems has been lacking. Here we compared the Sleeping Beauty (SB), piggyBac (PB), and Tol2 transposons with respect to overall activity, overproduction inhibition (OPI), target site selection, transgene copy number as well as long-term expression in human cells. SB was the most efficient system under conditions where the availability of the transposon DNA is limiting the transposition reaction including hard-to-transfect hematopoietic stem/progenitor cells (HSCs), and the most sensitive to OPI, underpinning the need for careful optimization of the transposon components. SB and PB were about equally active, and both more efficient than Tol2, under nonrestrictive conditions. All three systems provided long-term transgene expression in human cells with minimal signs of silencing. Indeed, mapping of Tol2 insertion sites revealed significant underrepresentation within chromosomal regions with H3K27me3 histone marks typically associated with transcriptionally repressed heterochromatin. SB, Tol2, and PB constitute complementary research tools for gene transfer in mammalian cells with important implications for fundamental and translational research