Expresión de Proteínas en la levadura Pichia pastoris

Se considera una proteína recombinante o proteína heteróloga aquella proteína cuya síntesis se realiza en un organismo distinto al organismo nativo.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Mejora de Biocatalizadores por ingeniería de proteínas

La catálisis es un proceso que aumenta la velocidad con la que una reacción alcanza el equilibrio. Dado que la velocidad de reacción depende de la energía libre de activación, un catalizador provoca la disminución de la barrera de energía y acelera la etapa catalítica. Las enzimas son moléculas que pueden reducir la energía de activación de la reacción y por lo tanto acelerar las reacciones bioquímicas que tienen lugar en la célula.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Fast and economic immobilization methods described for non-commercial Pseudomonas lipases

There is an increasing interest to seek new enzyme preparations for the development of new products derived from bioprocesses to obtain alternative bio-based materials. In this context, four non-commercial lipases from Pseudomonas species were prepared, immobilized on different low-cost supports, and examined for potential biotechnological applications. Results: To reduce costs of eventual scaling-up, the new lipases were obtained directly from crude cell extracts or from growth culture supernatants, and immobilized by simple adsorption on Accurel EP100, Accurel MP1000 and Celite (R) 545. The enzymes evaluated were LipA and LipC from Pseudomonas sp. 42A2, a thermostable mutant of LipC, and LipI. 3 from Pseudomonas CR611, which were produced in either homologous or heterologous hosts. Best immobilization results were obtained on Accurel EP100 for LipA and on Accurel MP1000 for LipC and its thermostable variant. Lip I. 3, requiring a refolding step, was poorly immobilized on all supports tested ( best results for Accurel MP1000). To test the behavior of immobilized lipases, they were assayed in triolein transesterification, where the best results were observed for lipases immobilized on Accurel MP1000. Conclusions: The suggested protocol does not require protein purification and uses crude enzymes immobilized by a fast adsorption technique on low-cost supports, which makes the method suitable for an eventual scaling up aimed at biotechnological applications. Therefore, a fast, simple and economic method for lipase preparation and immobilization has been set up. The low price of the supports tested and the simplicity of the procedure, skipping the tedious and expensive purification steps, will contribute to cost reduction in biotechnological lipase-catalyzed processes

Desempeño del Kit ELISA Chagas IICS V.1 para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

En Paraguay, el tamizaje serológico para la enfermedad de Chagas en bancos de sangre es necesario, por lo cual es importante un método diagnóstico con alta sensibilidad. El ELISA Chagas test IICS V.1 es un ELISA indirecto sensibilizados con antígeno soluble de epimastigote de T.cruzide la cepa Ypsilon. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el desempeño del ELISA Chagas test IICS V.1 en comparación con kits comerciales, ademásanalizar los resultados de la evaluación externa e interna de calidad del kit. En este estudio observacional de prueba diagnóstica se analizaron 56 muestras de suerospositivos y negativos para antígenos de Trypanosoma cruzi, testados por el ELISA BiosChile, obteniéndose una concordancia excelente entre el ELISA Chagas test IICS V.1y los kits comerciales: Chagatest ELISA-Wiener, con Índice kappa: 0,89 IC de 95% (0,76-1) y Test ELISA para Chagas III-Grupo BiosChile con Índice kappa: 0,92 IC 95% (0,82-1).En la evaluación externa de calidad realizada por la Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo, Brasil en el periodo 2001 al 2012 se analizaron 450 muestras: 372 negativas y 78 positivas para T. cruzi, obteniéndose en dicha evaluación la calificación “A” que indica ausencia de falsos positivos y negativos. Además, en el mismo periodo los valores del control interno se encontraron dentro del rango permitido de ±2DS. Los resultados obtenidos en el estudio demuestran la alta calidad de este test de producción nacional, que sumado al bajo costo del mismo, pueden ser utilizados en trabajos de campo, donde no necesita de instrumentación y las lecturas pueden realizarse a simple vista, constituyendo una herramienta válida y útil para el apoyo al diagnóstico de la enfermedad de Chagas

Perfil clínico, hematológico y serológico en pacientes con sospecha de dengue del IICS-UNA, 2009-2013

El dengue constituye una de las enfermedades transmitidas por mosquitos más importante a nivel mundial. La enfermedad puede cursar con un cuadro asintomático, presentarse con un amplio rango de manifestaciones clínicas inespecíficas o cierto porcentaje puede derivar en casos graves. Este estudio observacional descriptivo de corte transverso tuvo como objetivo determinar las características clínicas, parámetros hematológicos y presencia de IgM en 92 pacientes que acudieron al IICS-UNA con sospecha clínica de dengue en el periodo 2009 al 2013. Se utilizó el MAC-ELISA desarrollado en el IICS-UNA, se registraron los datos clínicos-epidemiológicos a través de una encuesta y se determinaron los parámetros hematológicos. Se obtuvieron resultados positivos para IgM en 51/92 (55%) pacientes y resultados negativos en 41/92 (45%). Las características clínicas más frecuentes fueron: fiebre, cefalea, mialgias y artralgias. Entre los pacientes con IgM positiva, 14/51 (27%) manifestaron dolores abdominales, 19/51 (37%) reportaron letargo o postración y 20/51 (39%) declararon tener náuseas y/o vómitos, 4/51 (8%) presentaron leucopenia, 10/51 (20%) valores de hematocrito disminuido y 6/51 (12%) plaquetopenia. Sólo 13/92 (14%) pacientes declararon haber cursado con la enfermedad anteriormente. Del total de pacientes, 4/92 (4%) manifestaron haber presentado algún tipo de hemorragia. Los resultados obtenidos en el estudio refuerzan la importancia de integrar todos los parámetros posibles: detección de IgM, perfil hematológico y la clínica del paciente con sospecha de dengue para brindar un mejor diagnóstico. Así también, es necesario resaltar en cuanto a los signos de alarma para una intervención rápida a fin de evitar complicaciones

Seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la toxoplasmosis en mujeres en edad reproductiva que acudieron al Hospital Distrital de Lambaré, Paraguay

La toxoplasmosis es una enfermedad zoonótica de prevalencia mundial, causada por un parásito intracelular Toxoplasma gondii que infecta a los seres vivos y tiene como hospedador definitivo a los felinos. El presente estudio tuvo como objetivo determinar la seroprevalencia de toxoplasmosis y factores de riesgo asociados en mujeres en edad reproductiva no embarazadas que asistieron al Hospital Distrital de Lambaré, Paraguay. Se obtuvieron muestras de suero de 185 mujeres y se analizaron mediante ELISA Toxo IICS-UNA para la detección de anticuerpos IgG específicos contra T. gondii. Se utilizaron encuestas diseñadas para recoger datos demográficos y factores de riesgo. Se aplicó estadística descriptiva y la prueba de chi-cuadrado y OR (odds ratio) para establecer asociación entre las variables higiénicas, alimenticias y de conocimiento con la toxoplasmosis. De las 185 participantes, 117 presentaron IgG anti-T gondii, que representa una prevalencia de 63% IC95 (56,2-69,7%). El nivel de conocimiento fue el único factor de riesgo que se asoció en forma significativa con la serología positiva para toxoplasmosis. Aunque los demás factores de riesgo no alcanzaron significancia estadística, probablemente debido a la alta seroprevalencia en esta población, sin lugar a duda los mismos contribuyen en gran medida a la propagación de la infección

Caracterización del perfil antigénico de extractos proteicos solubles de cepas de Trypanosoma cruzi

El parásito Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El mismo presenta una amplia diversidad biológica y genética, por lo cual se lo agrupa en 6 unidades taxonómicas discretas. Las cepas Y, CL Brener y una aislada en Paraguay aún no caracterizada en su totalidad fueron empleadas en este estudio con el fin de determinar sus perfiles proteico y antigénico para aportar en la investigación sobre esta enfermedad en nuestro país, aplicando técnicas como SDS-PAGE, ELISA y Western blot. Se observaron semejanzas en los perfiles proteicos de los extractos solubles de Y Lote 73 e Y Lote 74, siendo ambos obtenidos a partir de la misma cepa, así como perfil diferente de éstos con los de CL Brener y Py. Se detectaron bandas de proteínas de pesos moleculares comunes entre extractos, principalmente las consideradas de bajo peso molecular. Se constató la capacidad antigénica al ensayar los 4 extractos frente a sueros chagásicos, no chagásicos, controles positivos y negativos, se evidenció la importancia de confirmar el diagnóstico con pruebas de principios diferentes. Además, se detectaron proteínas antigénicas comunes a los 3 extractos empleados en el Western blot, las que podrían ser estudiadas con mayor profundidad debido a su potencial antigénico, característica de interés para fines diagnósticos

Antigenic profile characterization of soluble protein extracts from two Trypanosoma cruzi strains

Autor correspondiente: María Eugenia Acosta de Hetter. Departamento de Producción, Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción. Paraguay. Email: [email protected] parásito Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El mismo presenta una amplia diversidad biológica y genética, por lo cual se lo agrupa en 6 unidades taxonómicas discretas. Las cepas Y, CL Brener y una aislada en Paraguay aún no caracterizada en su totalidad fueron empleadas en este estudio con el fin de determinar sus perfiles proteico y antigénico para aportar en la investigación sobre esta enfermedad en nuestro país, aplicando técnicas como SDS-PAGE, ELISA y Western blot. Se observaron semejanzas en los perfiles proteicos de los extractos solubles de Y Lote 73 e Y Lote 74, siendo ambos obtenidos a partir de la misma cepa, así como perfil diferente de éstos con los de CL Brener y Py. Se detectaron bandas de proteínas de pesos moleculares comunes entre extractos, principalmente las consideradas de bajo peso molecular. Se constató la capacidad antigénica al ensayar los 4 extractos frente a sueros chagásicos, no chagásicos, controles positivos y negativos, se evidenció la importancia de confirmar el diagnóstico con pruebas de principios diferentes. Además, se detectaron proteínas antigénicas comunes a los 3 extractos empleados en el Western blot, las que podrían ser estudiadas con mayor profundidad debido a su potencial antigénico, característica de interés para fines diagnósticos.The parasite Trypanosoma cruzi is the causal agent of Chagas disease. It presents a wide biological and genetic diversity, therefore it is grouped into 6 taxonomic units. The strains Y, CL Brener and one strain isolated in Paraguaywere used in this study in order to determine their protein and antigenic profiles, applying techniques such as SDS-PAGE, ELISA and Western blot. Similarities were observed in the protein prifles of the soluble extracts of Lot 73 Y and Lot 74 Y both obtained from the same strain, and the different profile of these with those of CL Brener and Py strains. Protein bands of common molecular weights, manly those considered low, were detected between extracts. By testing the four extracts against chagasic and non-chagasic sera, positive and negative controls, the antigenic capacity was verified and the importance of utilizing different test to confirm diagnosis was shown. In addition antigenic proteins common to the three extracts used in the Western blot were detected and can be further investigated due to their antigenic potential, an interesting characteristic for diagnostic purpose.Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPrograma Paraguayo para el Desarrollo de la Ciencia y Tecnología. Proyectos de investigación y desarroll

Perfil antigénico de extractos proteicos solubles de dos cepas de Trypanosoma Cruzi

El objetivo general del trabajo fue caracterizar el perfil antigénico de los extractos proteicos solubles de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Novel Lipases: Expression and Improvement for Applied Biocatalysis = Nuevas lipasas: expresión y mejoras para biocatálisis aplicadatalysi Novel Lipases: Expression and Improvement for Applied Biocatalysis = Nuevas lipasas: expresión y mejoras para biocatálisis aplicada

[eng] This thesis is focused in the identification and improvement of lipases for biotechnological application. The importance of lipases is increasing in several industries. However, the commercial use of lipases is still a drawback in the economics of the lipase-based industrial applications. There are many tools for improving and adapting the enzyme properties to the desired requirements of a process that could lead lipase catalysis through a cost-effective process. In this context, the main objective of this work was: “To characterize, express and to improve novel bacterial lipases for sustainable industrial processes”. The first activity done was to explore and to characterize a new esterase from P. barcinonensis. It was isolate from P. barcinonensis the gene corresponding to Est23, and its cloning in a proper vector to perform expression and purification for biochemical characterization. Est23 showed preference for mid-chain substrates and having maximum activity at 37 °C and pH 7. It also includes in silico analysis of the 3D model structure and phylogeny. Moreover, a phylogenetic tree was constructed to assign Est23 to one of the bacterial hydrolase families described by Arpingy and Jaeger. Est23 could not be assigned to any bacterial hydrolases described till that moment, suggesting that Est23 could be part of a new group of bacterial lipases. Because Est23 displays a GGG(A)X-type putative oxyanion hole, widely described as a motif involved in tertiary alcohol resolution, the ability of Est23 for conversion and resolution of tertiary alcohols was evaluated. However, no conversion was detected using the esters linalyl and terpinyl acetate alcohols as substrates. To improve LipR activity by protein engineering LipR was then desired. LipR was isolated from Rhodococcus sp. strain CR-53 in a previous and showed an unusual fungal-like oxyanion-hole never found among bacterial lipases, close to the Y-type oxyanion hole described for Candida antartica lipase A (CalA), a lipase widely used in industry. In order to improve LipR activity on long-chain substrates, several enzyme-engineering approaches were done to change the amino acids constituting the rare oxyanion hole of LipR for further industrial application. These mutations also allowed studying the role of the amino acids forming the oxyanion hole of LipR. Hydrolytic activity over short, mid and long- chain substrates was assayed with the variants obtained. The LipR variant Asp111Gly produced a change on the chain- length- substrate preference of LipR, displaying a 5.6 fold increase of activity on muf-oleate. This improvement of activity on longer chain length substrates makes of this LipR variant a very attractive candidate for testing activity on biodiesel synthesis, a process requiring activity on long-chain substrates. Nevertheless, LipR and LipR_YGS variant need a clear expression enhancement in order to apply them to transesterification reactions using oily feedstocks. The stabilization Pseudomonas lipases LipA, LipC and LipCmut was improved by immobilization in order to applied these enzymes in transesterification reactions. Therefore, a fast and economic immobilization procedure by adsorption was set up. Finally, the three immobilized lipase preparations and a commercial lipase were used to test alternative feedstocks for triglyceride transesterification. A total of four oils were tested: commercial triolein, degummed soybean oil, waste cooking oil, and Mucor circinelloides oil. Moreover, the characterization of the tested raw materials in terms of FFAs, tri, di and monoglyceride contents measure was also of interest. In a global analysis, a good increase of FAMEs percent was obtained with LipA, LipC and LipCmut immobilized on Accurel MP1000. But better results were achieved when the reactions were catalyzed by Novozym® 435 commercial enzyme.[spa] Esta tesis se centra en la identificación y mejora de lipasas para aplicaciones biotecnológicas. El objetivo principal de este trabajo fue: "Caracterizar, expresar y mejorar las nuevas lipasas bacterianas para procesos industriales sostenibles". La primera actividad realizada fue explorar y caracterizar una nueva esterasa, Est23, de P. barcinonensis. Se aisló de P. barcinonensis el gen correspondiente a Est23 y su clonación en un vector adecuado para realizar la expresión y purificación para caracterización bioquímica. Además, se construyó un árbol filogenético para asignar Est23 a una de las familias de hidrolasas bacterianas descritas por Arpingy y Jaeger, y debido a que Est23 tiene un oxyanion-hole de tipo GGG (A) X, ampliamente descrito como motivo implicado en la resolución del alcohol terciario, se evaluó la capacidad de Est23 en dichas reacciones. Luego se buscó mejorar la actividad sobre sustratos de cadena larga de la lipasa LipR de Rhodococcus sp. por ingeniería de proteínas. Diferentes enfoques de ingeniería enzimática se realizaron para cambiar los aminoácidos que forman parte del atípico oxyanion-hole de LipR. Estas mutaciones también permitieron estudiar el papel de los aminoácidos que forman este motivo. La actividad hidrolítica de las variantes obtenidas fue ensayada sobre sustratos de cadena corta, media y larga. La variante LipR Asp111Gly produjo un cambio en la preferencia de LipR de longitud de cadena. Sin embargo, LipR y LipR_YGS necesitan un aumento de expresión para aplicarlos a reacciones de transesterificación. La estabilización de tres lipasas de Pseudomonas, LipA, LipC y LipCmut, se mejoró por inmovilización con el fin de aplicar estas enzimas en las reacciones de transesterificación. Por lo tanto, se estableció un procedimiento de inmovilización por adsorción rápido y económico. Finalmente, se usaron las tres lipasa inmovilizadas y una lipasa comercial para probar materias primas alternativas para la transesterificación de triglicéridos. Se probaron un total de cuatro aceites: trioleína comercial, aceite de soja desgomado, aceite de cocina de desecho y aceite de Mucor circinelloides. Además se realizó la caracterización de las materias primas ensayadas en términos de la medida de los ácidos grasos, tri, di y monoglicéridos