bFcRn transzgenikus juh előállítása = Generation of the bFcRn transgenic sheep

Munkacsoportunk (ELTE, Immunológiai Tsz) a szarvasmarha neonatalis Fc receptor (bFcRn) szerepét vizsgálja az IgG homeosztázisban (maternális immuntranszport, katabolizmus, humorális immunválasz). Jelen pályázatunk célja az volt, hogy a bFcRn túltermelés hatását a kiskérődző juhban is ellenőrizzük, ill. a kérődzőkre jellemző kérdésekben – tőgy IgG szekréció – pontosítsuk. Terveink szerint egy kollaborációs együttműködés keretében a Roslin Intézettel közösen az ún. lentivírus transzgenezis (tg) révén bFcRn-t túltermelő juhokat hozzunk létre és ezeket az állatokat elemezzük. Az ELTE munkacsoportja ebben a kutatásban vállalta és sikerrel végrehajtotta, hogy a bFcRn promoteréből és cDNS-ből egy olyan konstrukciót készít, amelyet a Roslin Intézetben lentivírusba illeszthetnek. Továbbá, hazai együttműködésben sikerült ebből egy lentivírust is előállítani, amellyel a konstrukciót sikeresen validáltuk (RT-PCR, Western blot). Előállítottunk továbbá olyan ovalbumin specifikus juh szérumot, amellyel a későbbiekben a tg juhok in vivo vizsgálatát tervezzük végrehajtani. A Roslin Intézet munkatársai szintén sikeresen állítottak elő lentivírust az általunk létrehozott konstrikcióból, azt in vitro vizsgálatok során tesztelték, majd bFcRn tg egereket hoztak létre. A konstrukcióval 2008 év elején juh zigótákat fertőztek, de sajnos ezek nem voltak sikeresek. A juh szaporodásának szezonális viszonyai miatt a munkát 2009-ben folytatjuk. | Our group (Dept.Immunology, ELTE) analyze the role of the bovine neonatal Fc receptor (bFcRn) in IgG homeostasis (maternal immune transport, catabolism, humoral immune response). The aim of the current application was to investigate the effect of the bFcRn overexpression in the sheep as small ruminant, especially in ruminant specific functions, such as the IgG secretion in the mammary gland. In order to achieve these goals we intended to generate and analyze transgenic sheep using lentivirus technology that overexpress the bFcRn in a collaborative effort with The Roslin Institute. Our group at ELTE was required and successfully performed to generate a construct composed of the bFcRn promoter and cDNA segments that could be used to create a lentiviral vector at The Roslin Institute. In addition, together with a Hungarian company, we created a lentiviral vector from this construct which we successfully validated (RT-PCR, Western blot). We also generated ovalbumin specific sheep antiserum which can be used later to in vivo analyze the tg sheep. Our colleagues at The Roslin Institute have successfully used our construct to create their own lentiviral vector, which they tested in vitro and generated bFcRn tg mice. They also attempted to create tg sheep by infecting sheep zygotes with these lentiviruses, however these attempts were not successful. Due to the seasonality of the sheep reproduction, we will continue this work in 2009

Disztrofin fehérjék a neuronokban és a glia sejtekben = Dystrophin proteins in neurons and glial cells

A disztrofin-disztroglikán komplexet (DGC) vizsgáltuk neuronokban és glia sejtekben. Tenyésztett Müller glia sejtekben a 71 kDa-os disztrofin forma egyik splice-variánsának (Dp71f) eloszlása független a disztroglikántól, míg az utrophin és a disztroglikán kolokalizációt mutat. A fehérjék lokalizációja és kolokalizációs mintázata hasonló nyugvó és vándorló sejtekben, és nem változik meg laminin hátására. A lamininnak a Müller glia sejtekre gyakorolt motilitásnövelő hatása jelentős részben a laminin-DGC kölcsönhatás következménye. A mozgó sejtek irányváltoztatási gyakorisága és a nyugvó sejtek nyúlvány-dinamizmusa nem függ a laminin jelenlététől. A hippocampus CA3 régiójában a Dp71f kis aszimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus elemében, továbbá a moharostok membránján és egyes kis átmérőjű myelinhüvelyes axonokban van jelen. A Dp71f jelen van az asztrocitákban, a sejttestben és a nyúlványokban egyaránt. A fehérje a gliális fibrilláris proteint és laminint is expresszáló asztrocita populációkban fordul elő. A laterális hypothalamikus terület egyes neuronjai alfa-disztrobrevint (a-DB) expresszálnak. Az a-DB pozitív neuronok melanin koncentráló hormon immunreaktivitást mutatnak. Az a-DB a perikaryonokban és a nyúlványokban is jelen van. Az a-DB megjelenik a perivascularis glia végtalpakban, ezen belül az endothel sejteket és végtalpat elválasztó lamina basalissal érintkező membránon lokalizálódik. | Proteins of the dystrophin-associated glycoprotein complex have been localized by light and electronmicroscopic technique in neurons and glial cells. In primary cultures of retinal Muller glial cells the distribution of Dp71f, one of the splice variants of the 71 kDa dystrophin protein, has been shown to be independent of the distribution of dystroglycan, while utrophin and dystroglycan colocalized in clusters in all parts of the cells. The colocalization pattern was similar in resting and migrating cells and it was independent of the presence of laminin. The laminin-induced motility of Muller cells has been proven to be dependent on laminin-dystroglycan interaction. Dystroglycan function does not seem to be involved in the laminin-dependent increase of the direction-changing activity of the migrating cells and the process dynamism of the resting ones. Dp71f positivity has been demostrated in glial fibrillary acidic protein and laminin producing astrocytes. In the CA3 region of the hippocampus, Dp71f has been localized in the postsynaptic density of small asymmetric axospinous and axodendritic synapses. Furthermore, the protein was present on the membranes of the mossy fibers and in the axon proper of small-caliber myelinated axons. Alpha-dystrobrevin (a-DB) immunoreactivity was demonstrated on the endothelium-facing membrane of the perivascular astrocytes and in melanin-concentrating hormone producing neurons within the lateral hypothalamic area

A nyúl neonatális FC receptor klónozása, jellemzése = Cloning and characterisation of the rabbit neonatal FC receptor

Az emlősök szervezetében található immunglobulinok közül legjelentősebb az IgG, mely a fertőzésekkel szemben biztosít védelmet. A neonatális Fc receptor (FcRn) dimer molekula, nehéz lánca az MHC-I osztályú fehérjékhez tartozik. A molekula részt vesz az anyai IgG utódoknak történő átadásában, a szérum IgG szintjének fenntartásában, és az immunválaszban –fagocitózisban és antigén prezentációban. A főemlősökhöz hasonlóan nyúlban az anyai immun transzport folyamatok a magzati korban történnek a szikzacskón keresztül. Bár a nyúlban a transzport folyamatát már vizsgálták, a receptor molekulát még nem klónozták és jellemezték. Hogy pontosan megértsük a nyúlban, mint modellállatban az FcRn működését RACE PCR-el klónoztuk a nyúl FcRn nehéz láncát és jellemeztük. Megállapítottuk, hogy nagy hasonlóságot mutat az ismert emlős ortológokhoz. Részletesen vizsgáltuk a gén expresszióját a placentában, az amnionban és a szikzacskóban. A receptor megjelenik a placenta kapilláris endotél sejtjeiben és a szikzacskó endoderm sejtek apikális régiójában. RNS szinten kimutattuk jelenlétét monocitákban és makrofágokban is. Megállapítottuk, hogy a nyúl FcRn pH függő módon működik. A fenti vizsgálatok igazolják, hogy az általunk klónozott és jellemzett receptor a nyúl FcRn. | IgG is the most important immunoglobulin in mammals. IgG protects against infections. The neonatal Fc receptor (FcRn) is a dimer its heavy chain is similar in structure to MHC class I proteins. Multiple functions have been shown for neonatal Fc receptor, as it mediates maternal transfer of IgG to offsprings, responsible for the maintenance of serum IgG level and plays an important role in immune respons-phagocytosis and antigen presentation. Like primates, rabbit maternal IgG transport occurs during the fetal life and mediated by the FcRn through the yolk sac. Although, there were several studies in analyzing IgG transport in rabbit yolk sac, the rabbit FcRn has not been cloned and analyzed so far. In order to have a better understanding in this valuable model, first we cloned the rabbit FcRn using RACE PCR and found that the coding region of the rabbit FcRn alpha-chain shows high similarity to the other mammalian orthologues. We also characterized the rabbit FcRn by detecting its expression in monocytes, macrophages, fetal placenta, yolk sac and amnion, though this last one presented less FcRn expression, by RT-PCR. We detected this receptor in the endothelial cells of the placental capillaries as well as in the apical region of endoderm cells in the yolk sac. We found that the rabbit FcRn, binds IgG in a pH dependent manner, like its other mammalian FcRns. These results confirm that the rabbit Fc receptor in the rabbit yolk sac is a bona fide FcRn receptor

A szarvasmarha neonatalis Fc receptor (bFcRn) által mediált IgG katabolizmus és epithelialis transzport molekuláris szintű elemzése = Studies on the bovine FcRn mediated IgG catabolism and epithelial transport at molecular level

A pályázat révén jelentősen bővítettük a szarvasmarha FcRn (bFcRn) szerepéről alkotott ismereteinket arról hogyan szabályozza ez a receptor az IgG homeosztázisát. Egyik legfontosabb eredményünknek tartjuk, hogy tisztáztuk a bFcRn szerepét tőgy IgG transzport folyamatában. Felületi plazmon rezonancia elemzéseinkkel kimutattuk, hogy a receptor lényegesen nagyobb affinitással kötődik a bovin IgG2, mint az IgG1 izotípushoz. A tejmirigyben kifejeződő bFcRn transzgenikus egerek elemzésével pedig megállapítottuk, hogy a nagyobb mértékű receptor kifejeződés jelentősen növeli az állatok szérum IgG szintjét, és csak kismértékben a tej IgG koncentrációját. E két megfigyelés alapján kijelenthető, hogy a bFcRn a tőgyben nem az IgG1-et szekretálja, hanem az IgG2-t juttatja vissza a keringésbe, megakadályozza ennek az izotípusnak a tejbe történő kiürülését. Szarvasmarhában végzett IgG kiürülési vizsgálatainkkal megállapítottuk, hogy a bFcRn aktívan közreműködik az IgG lebomlásának szabályozásában. A bFcRn-t faj-specifikus, test szerte kifejeződő transzgenikus egerekben végzett elemzéseink kimutatták, hogy az FcRn kifejeződésének fokozása csökkenti az IgG lebomlását és immunizálást követően fokozza az antigén specifikus B limfociták termelődését. Ennek köszönhetően ezeknek az állatoknak az antigén specifikus ellenanyag termelése lényegesen meghaladja a hagyományos állatokét. Ez utóbbi felismerés gazdasági hasznosítására a kutatók létrehozták az ImmunoGenes Kft-et (www.immunogenes.com). | In the frame of this grant, we significantly extended our knowledge about the role of the bovine FcRn (bFcRn) in the IgG homeostasis. One of our most important results was to clarify the role of this receptor in the IgG transport during colostrum formation. By using surface plasmon resonance assay, we could show that the FcRn binds to bovine IgG2 at a much higher affinity as compared to the IgG1 isotype. Transgenic mice that express bFcRn exclusively in their mammary gland during lactation showed significantly higher serum IgG level, while the IgG concentration in the milk was only slightly increased. Based on these two observations, we concluded that the bFcRn recycles IgG2 to the blood from the mammary gland, instead of secreting IgG1 into colostrums/milk. Results on IgG clearance studies in cattle showed that the bFcRn plays an important role in IgG protection regulating its catabolism. Our other transgenic mice that express the bFcRn in species specific mode throughout the body showed reduced IgG catabolism and enhanced antigen specific B cell production upon immunization. Due to these two effects the antigen specific antibody production is significantly improved in these animals. Based on this latter observation researchers founded ImmunoGenes Kft (www.immunogenes.com) to execute a plan towards creating a profitable company

Folyadékbiopszia-vizsgálatok alkalmazási lehetőségei az onkohematológiában

A molekuláris biológiai technikák utóbbi évtizedekben látott fejlődésének köszönhetően a vérplazmában keringő biomolekuláknak, így például a tumor eredetű sejtmentes DNS-fragmentumoknak is korábban elképzelhetetlen mélységű vizsgálata vált elérhetővé. A minimális invazivitással járó folyadékbiopsziás mintavétel metasztatikus tumorok esetében lehetővé teszi eltérő anatómiai lokalizációval megjelenő genetikai aberrációk egyidejű feltérképezését, azok nyomon követését, illetve a klonális evolúció következtében megjelenő további abnormalitások kimutatását is. Ebből következően számos, szolid tumorokat vizsgáló, folyadékbiopsziás mintavételt alkalmazó tanulmány jelent meg az utóbbi évtizedben, néhány entitás vonatkozásában pedig az eljárás már a rutindiagnosztikában is alkalmazásra került. Onkohematológiában az ebből a szempontból legintenzívebben kutatott megbetegedések közé a diff úz nagy B-sejtes limfóma, a Hodgkin-limfóma, illetve a plazmasejtes mielóma tartozik. Saját, illetve irodalmi adatok alapján a tumor eredetű sejtmentes DNS vizsgálata hasznos lehet a kezelést megelőző prognózisbecslésben, a célozható molekuláris eltérések azonosításában, a terápiás hatékonyság és a minimális reziduális betegség monitorozásában, valamint a terápiarezisztens klónok kimutatásában. Jelen összefoglaló közleményünkben a folyadékbiopszia-vizsgálatok onkohematológiai alkalmazásait tekintjük át

Characterization of the Rabbit Neonatal Fc Receptor (FcRn) and Analyzing the Immunophenotype of the Transgenic Rabbits That Overexpresses FcRn

The neonatal Fc receptor (FcRn) regulates IgG and albumin homeostasis, mediates maternal IgG transport, takes an active role in phagocytosis, and delivers antigen for presentation. We have previously shown that overexpression of FcRn in transgenic mice significantly improves the humoral immune response. Because rabbits are an important source of polyclonal and monoclonal antibodies, adaptation of our FcRn overexpression technology in this species would bring significant advantages. We cloned the full length cDNA of the rabbit FcRn alpha-chain and found that it is similar to its orthologous analyzed so far. The rabbit FcRn - IgG contact residues are highly conserved, and based on this we predicted pH dependent interaction, which we confirmed by analyzing the pH dependent binding of FcRn to rabbit IgG using yolk sac lysates of rabbit fetuses by Western blot. Using immunohistochemistry, we detected strong FcRn staining in the endodermal cells of the rabbit yolk sac membrane, while the placental trophoblast cells and amnion showed no FcRn staining. Then, using BAC transgenesis we generated transgenic rabbits carrying and overexpressing a 110 kb rabbit genomic fragment encoding the FcRn. These transgenic rabbits – having one extra copy of the FcRn when hemizygous and two extra copies when homozygous - showed improved IgG protection and an augmented humoral immune response when immunized with a variety of different antigens. Our results in these transgenic rabbits demonstrate an increased immune response, similar to what we described in mice, indicating that FcRn overexpression brings significant advantages for the production of polyclonal and monoclonal antibodies

FcRn Overexpression in Transgenic Mice Results in Augmented APC Activity and Robust Immune Response with Increased Diversity of Induced Antibodies

Our previous studies have shown that overexpression of bovine FcRn (bFcRn) in transgenic (Tg) mice leads to an increase in the humoral immune response, characterized by larger numbers of Ag-specific B cells and other immune cells in secondary lymphoid organs and higher levels of circulating Ag-specific antibodies (Abs). To gain additional insights into the mechanisms underlying this increase in humoral immune response, we further characterized the bFcRn Tg mice. Our Western blot analysis showed strong expression of the bFcRn transgene in peritoneal macrophages and bone marrow derived dendritic cells; and a quantitative PCR analysis demonstrated that the expression ratios of the bFcRn to mFcRn were 2.6- and 10-fold in these cells, respectively. We also found that overexpression of bFcRn enhances the phagocytosis of Ag-IgG immune complexes (ICs) by both macrophages and dendritic cells and significantly improves Ag presentation by dendritic cells. Finally, we determined that immunized bFcRn mice produce a much greater diversity of Ag-specific IgM, whereas only the levels, but not the diversity, of IgG is increased by overexpression of bFcRn. We suggest that the increase in diversity of IgG in Tg mice is prevented by a selective bias towards immunodominant epitopes of ovalbumin, which was used in this study as a model antigen. These results are also in line with our previous reports describing a substantial increase in the levels of Ag-specific IgG in FcRn Tg mice immunized with Ags that are weakly immunogenic and, therefore, not affected by immunodominance