Ultraestructura y función mitocondrial en la célula cromafín del ratón SOD1G93A modelo de esclerosis lateral amiotrófica, en etapas pre-sintomáticas y sintomáticas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de lectura: 13-11-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 13-05-2021La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una afectación rápida de la motoneurona (MN) de los núcleos motores superiores e inferiores; ello provoca una parálisis muscular progresiva que avanza hasta el fracaso respiratorio que conduce a la muerte del paciente en 3 a 5 años. El 90 % de los casos son esporádicos, mientras que el 10 % restante se han relacionado con mutaciones genéticas hereditarias, la denominada ELA familiar (ELAf). Gracias al desarrollo de modelos animales basados en estas mutaciones, se ha conseguido avanzar en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad, siendo el modelo SOD1G93A el primero descrito y más estudiado. Se trata de una mutación en la enzima citosólica superóxido dismutasa 1 (SOD1), encargada del control del balance redox celular, mutación que acontece en el 20 % de los pacientes de ELAf. A día de hoy, se ha abordado la enfermedad a través de todos los mecanismos fisiopatológicos descritos (alteraciones en la transcripción y en el procesamiento de los ARN, alteraciones en el metabolismo proteico, excitotoxicidad y alteración de la homeostasia del calcio, estrés oxidativo, alteración del citoesqueleto y del transporte axonal, disfunción mitocondrial o neuroinflamación); sin embargo, no se ha logrado una cura eficaz, y tan solo se ha aprobado un tratamiento (riluzol) que consigue aumentar en dos meses el tiempo hasta la intubación del paciente, no teniendo efectos sobre la supervivencia. Además, aunque la afectación selectiva de la motoneurona sigue siendo una incógnita, se empieza a esclarecer la implicación de otros tipos celulares como la glía o el músculo. En el presente trabajo hemos centrado nuestra investigación en la mitocondria, pues se trata de un elemento central de toda la fisiopatología conocida. Hemos utilizado como modelo la célula cromafín (CC) del ratón SOD1G93A, por ser un interesante modelo de estudio de neurosecreción y de excitabilidad celular en el que ya hemos encontrado alteraciones en estados avanzados de la enfermedad. Ello nos puede ayudar a entender lo que sucede a nivel de mecanismos básicos, en la motoneurona, así como su relación con otros tipos celulares en el desarrollo de la ELA. Analizando tanto la estructura como la función mitocondrial en la CC de ratones a edad presintomática (P30) y sintomática (P120), hemos descubierto que con el desarrollo de la enfermedad existe un déficit en la fusión mitocondrial, pues el ratón transgénico presenta mayor número de mitocondrias pero de menor tamaño. Ultraestructuralmente destaca el hinchamiento de crestas acompañado de un mayor tamaño de las uniones de cresta, lo que repercute en un menor potencial de membrana mitocondrial. Estas alteraciones mitocondriales conducen a un cambio en el perfil bioenergético de la CC, pues se reduce la capacidad respiratoria máxima así como la de reserva bioenergética, impidiendo abastecer a la célula ante situaciones de gran demanda de energía y manteniendo unos niveles basales a costa de un consumo excesivo e ineficiente de sustratos. Además, aunque hemos confirmado una mayor generación de radicales libres, el menor consumo de oxígeno no mitocondrial pone de manifiesto la disfunción en rutas importantes para mantener la defensa antioxidante, pero también de rutas generadoras de ROS. Por lo tanto, la disfunción mitocondrial junto a la acción directa de la enzima mutada, se postulan como principales causantes del estrés oxidativo celular; ello se puede explicar por una alta expresión de la enzima mutada en la CC, que se acumula con la edad y colocaliza en la mitocondria. Finalmente, hemos caracterizado una menor expresión de la proteína mitocondrial OPA1, clave en la dinámica de la mitocondria y sus crestas, pero sin alteraciones en el procesamiento de sus isoformas, lo que parece indicar que existe un cambio a nivel de expresión, condicionado por el ambiente altamente oxidativo. Todos estos parámetros están alterados en la CC desde antes del inicio de los síntomas y se agravan con la instauración de la enfermedad. Por lo tanto, podemos concluir que en el modelo de ELA familiar SOD1G93A la afectación no es exclusiva de la motoneurona, puesto que existe también un deterioro de la CC desde etapas presintomáticas. Hemos identificado las alteraciones morfológicas mitocondriales que tienen una repercusión funcional, señalando a la proteína OPA1 como un actor principal en el proceso, y poniendo de manifiesto la importancia del metabolismo celular en el daño que se produce durante el desarrollo de la ELA. La importancia de este estudio, es que integra por vez primera el conjunto de la fisiopatología mitocondrial derivada de la mutación de la enzima SOD1 en un tipo celular no motoneuronal derivado del modelo murino SOD1G93A, tanto en estadios iniciales como finales de la enfermedad. Asimismo, se hace una conexión entre morfología, función, bioenergética y estrés oxidativo. La relación de nuestros resultados con los datos obtenidos en la motoneurona y otros tipos celulares como glía o músculo, demuestra que no entenderemos lo que sucede realmente en la ELA si no valoramos los distintos tipos celulares afectados, en función de su fenotipo metabólico.El trabajo realizado en la presente Tesis Doctoral fue financiado por las Instituciones Españolas mediante las ayudas económicas concedidas en los siguientes proyectos de investigación al Prof. Antonio G. García y de estudios de doctorado a Iago Méndez López: 1. Ayudas a proyectos de I+D, programa estatal de fomento de la investigación científica y técnica de excelencia. SAF2013-44108-P, Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España. 2. Ayudas a proyectos de I+D+I, programa estatal de investigación, desarrollo e innovación orientada a los retos de la sociedad, en el marco del plan estatal de investigación científica y técnica y de innovación 2013-2016, convocatoria 2016. 2016-78892-R, Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España. 3. Ayudas para contratos predoctorales para la formación de doctores 2014. BES- 2014-069005, Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España y Fondo Social Europeo. 4. Ayudas a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centros de I+D, convocatoria 2016. EEBB-I-17-12697, Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, Gobierno de España. 5. Ayudas a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centros de I+D, convocatoria 2017. Referencia: EEBB-I-18-13033, Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, Gobierno de España. Quisiera agradecer especialmente al Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, por la beca predoctoral FPI concedida durante los años 2015-2019 y al continuo apoyo de la Fundación Teófilo Hernand

The purinergic P2X7 receptor as a potential drug target to combat neuroinflammation in neurodegenerative diseases

Neurodegenerative diseases (NDDs) represent a huge social burden, particularly in Alzheimer's disease (AD) in which all proposed treatments investigated in murine models have failed during clinical trials (CTs). Thus, novel therapeutic strategies remain crucial. Neuroinflammation is a common pathogenic feature of NDDs. As purinergic P2X7 receptors (P2X7Rs) are gatekeepers of inflammation, they could be developed as drug targets for NDDs. Herein, we review this challenging hypothesis and comment on the numerous studies that have investigated P2X7Rs, emphasizing their molecular structure and functions, as well as their role in inflammation. Then, we elaborate on research undertaken in the field of medicinal chemistry to determine potential P2X7R antagonists. Subsequently, we review the state of neuroinflammation and P2X7R expression in the brain, in animal models and patients suffering from AD, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, multiple sclerosis, and retinal degeneration. Next, we summarize the in vivo studies testing the hypothesis that by mitigating neuroinflammation, P2X7R blockers afford neuroprotection, increasing neuroplasticity and neuronal repair in animal models of NDDs. Finally, we reviewed previous and ongoing CTs investigating compounds directed toward targets associated with NDDs; we propose that CTs with P2X7R antagonists should be initiated. Despite the high expectations for putative P2X7Rs antagonists in various central nervous system diseases, the field is moving forward at a relatively slow pace, presumably due to the complexity of P2X7Rs. A better pharmacological approach to combat NDDs would be a dual strategy, combining P2X7R antagonism with drugs targeting a selective pathway in a given NDD.The authors would like to acknowledge the support received from the EU Horizon 2020 Research and Innovation Program under Maria Sklodowska‐Curie (Grant Agreement No. 766124). The authors would also like to thank the support received from the Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO, Spain; Grant No. SAF2016‐78892R to Luis Gandía and Antonio G. García) and Fundación Teófilo Hernando

Progressive Mitochondrial SOD1G93A Accumulation Causes Severe Structural, Metabolic and Functional Aberrations through OPA1 Down-Regulation in a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis

In recent years, the “non-autonomous motor neuron death” hypothesis has become more consolidated behind amyotrophic lateral sclerosis (ALS). It postulates that cells other than motor neurons participate in the pathology. In fact, the involvement of the autonomic nervous system is fundamental since patients die of sudden death when they become unable to compensate for cardiorespiratory arrest. Mitochondria are thought to play a fundamental role in the physiopathology of ALS, as they are compromised in multiple ALS models in different cell types, and it also occurs in other neurodegenerative diseases. Our study aimed to uncover mitochondrial alterations in the sympathoadrenal system of a mouse model of ALS, from a structural, bioenergetic and functional perspective during disease instauration. We studied the adrenal chromaffin cell from mutant SOD1G93A mouse at pre-symptomatic and symptomatic stages. The mitochondrial accumulation of the mutated SOD1G93A protein and the down-regulation of optic atrophy protein-1 (OPA1) provoke mitochondrial ultrastructure alterations prior to the onset of clinical symptoms. These changes affect mitochondrial fusion dynamics, triggering mitochondrial maturation impairment and cristae swelling, with increased size of cristae junctions. The functional consequences are a loss of mitochondrial membrane potential and changes in the bioenergetics profile, with reduced maximal respiration and spare respiratory capacity of mitochondria, as well as enhanced production of reactive oxygen species. This study identifies mitochondrial dynamics regulator OPA1 as an interesting therapeutic target in ALS. Additionally, our findings in the adrenal medulla gland from presymptomatic stages highlight the relevance of sympathetic impairment in this disease. Specifically, we show new SOD1G93A toxicity pathways affecting cellular energy metabolism in non-motor neurons, which offer a possible link between cell specific metabolic phenotype and the progression of ALS

The quantal catecholamine release from mouse chromaffin cells challenged with repeated ACh pulses is regulated by the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger

Using caged-Ca photorelease or paired depolarising pulses in voltage-clamped chromaffin cells (CCs), various pools of secretory vesicles with different readiness to undergo exocytosis have been identified. Whether these pools are present in unclamped CCs challenged with ACh, the physiological neurotransmitter at the splanchnic nerve-CC synapse, is unknown. We have explored here whether an ACh-sensitive ready-release vesicle pool (ASP) is present in C57BL6J mouse chromaffin cells (MCCs). Single cells were fast perfused with a Tyrode solution at 37°C, and challenged with 12 sequential ACh pulses (100 μm, 2 s, every 30 s) plus a K pulse given at the end (75 mm K). After the first 2–3 ACh pulses the amperometrically monitored secretory responses promptly decayed to a steady-state level of around 25% of the initial response. The last K pulse, however, overcame such decay. Repeated ACh pulses to voltage-clamped cells elicited non-desensitising nicotinic currents. Also, the [Ca] transients elicited by repeated ACh pulses that were superimposed on a stable baseline elevation did not undergo decay. The novel blocker of the mitochondrial Na/Ca exchanger (mNCX) ITH12662 prevented the decay of secretion elicited by ACh pulses and delayed the rate of [Ca] clearance. The experiments are compatible with the idea that C57BL6J MCCs have an ASP vesicle pool that is selectively recruited by the physiological neurotransmitter ACh and is regulated by the rate of Ca delivery from mitochondria to the cytosol, through the mNCX.This study was supported by grants from Ministerio de Economıa y Competitividad, Spain (MINECO SAF2013-44108-P to A.G.G. and L.G., BFU2014-55731-R, to M.M., and FPI-BES-2014-069005 to I.M.). We thank the continued supportof Fundacion Teofilo Hernando.Peer Reviewe