Editorial: The Immunological Implications of the Hygiene Hypothesis

Human beings developed in close vicinity to their natural environment during their long-lasting history

Bioavailability and allergoprotective capacity of milk-associated conjugated linoleic acid in a murine model of allergic airway inflammation

BACKGROUND Cross-sectional epidemiological studies have demonstrated that farm milk from traditional farm settings possesses allergoprotective properties. Up to now, it has not been clarified which milk ingredient is responsible for protection against allergic diseases. As farm milk is rich in conjugated linoleic acids (CLA), it is hypothesized that this n-3 polyunsaturated fatty acid family contributes to the allergoprotective capacity of farm milk. We aim to prove this hypothesis in a murine model of allergic airway inflammation. METHODS To prove the bioavailability and allergoprotective capacity of milk-associated CLA in a standardized protocol, milk batches that differed significantly in terms of their CLA content were spray dried and incorporated into a basic diet by substituting the regular sunflower fat fraction. Initially, the milk CLA uptake from the diet was monitored via measurement of the CLA content in plasma and erythrocyte membranes obtained from supplemented mice. To determine whether a milk CLA-enriched diet possesses allergoprotective properties, female Balb/c mice were fed the milk CLA-enriched diet ahead of sensitization and a challenge with ovalbumin (OVA) and the parameters of airway inflammation and eisosanoid pattern were measured. RESULTS In animals, supplementation with a diet rich in milk CLA resulted in elevated CLA levels in plasma and erythrocyte membranes, indicating bioavailability of milk fatty acids. Though membrane-associated phospholipid patterns were affected by supplementation with milk CLA, this application neither reduced the hallmarks of allergic airway inflammation in sensitized and OVA-challenged mice nor modified the eiconsanoid pattern in the bronchoalveolar lavage fluid of these animals. CONCLUSION Milk-associated CLA was not capable of preventing murine allergic airway inflammation in an animal model of OVA-induced allergic airway inflammation

Pathogenicity of a disease-associated human IL-4 receptor allele in experimental asthma

Polymorphisms in the interleukin-4 receptor α chain (IL-4Rα) have been linked to asthma incidence and severity, but a causal relationship has remained uncertain. In particular, a glutamine to arginine substitution at position 576 (Q576R) of IL-4Rα has been associated with severe asthma, especially in African Americans. We show that mice carrying the Q576R polymorphism exhibited intense allergen-induced airway inflammation and remodeling. The Q576R polymorphism did not affect proximal signal transducer and activator of transcription (STAT) 6 activation, but synergized with STAT6 in a gene target– and tissue-specific manner to mediate heightened expression of a subset of IL-4– and IL-13–responsive genes involved in allergic inflammation. Our findings indicate that the Q576R polymorphism directly promotes asthma in carrier populations by selectively augmenting IL-4Rα–dependent signaling

Allergen-induced asthmatic responses modified by a GATA3-specific DNAzyme

BACKGROUND : The most prevalent phenotype of asthma is characterized by eosinophil-dominated inflammation that is driven by a type 2 helper T cell (Th2). Therapeutic targeting of GATA3, an important transcription factor of the Th2 pathway, may be beneficial. We evaluated the safety and efficacy of SB010, a novel DNA enzyme (DNAzyme) that is able to cleave and inactivate GATA3 messenger RNA (mRNA). METHODS : We conducted a randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter clinical trial of SB010 involving patients who had allergic asthma with sputum eosinophilia and who also had biphasic early and late asthmatic responses after laboratory-based allergen provocation. A total of 40 patients could be evaluated; 21 were assigned to receive 10 mg of SB010, and 19 were assigned to receive placebo, with each study drug administered by means of inhalation once daily for 28 days. An allergen challenge was performed before and after the 28-day period. The primary end point was the late asthmatic response as quantified by the change in the area under the curve (AUC) for forced expiratory volume in 1 second (FEV1). RESULTS : After 28 days, SB010 attenuated the mean late asthmatic response by 34%, as compared with the baseline response, according to the AUC for FEV1, whereas placebo was associated with a 1% increase in the AUC for FEV1 (P = 0.02). The early asthmatic response with SB010 was attenuated by 11% as measured by the AUC for FEV1, whereas the early response with placebo was increased by 10% (P = 0.03). Inhibition of the late asthmatic response by SB010 was associated with attenuation of allergen-induced sputum eosinophilia and with lower levels of tryptase in sputum and lower plasma levels of interleukin-5. Allergen-induced levels of fractional exhaled nitric oxide and airway hyperresponsiveness to methacholine were not affected by either SB010 or placebo. CONCLUSIONS : Treatment with SB010 significantly attenuated both late and early asthmatic responses after allergen provocation in patients with allergic asthma. Biomarker analysis showed an attenuation of Th2-regulated inflammatory responses

Maternal TLR signaling is required for prenatal asthma protection by the nonpathogenic microbe Acinetobacter lwoffii F78

The pre- and postnatal environment may represent a window of opportunity for allergy and asthma prevention, and the hygiene hypothesis implies that microbial agents may play an important role in this regard. Using the cowshed-derived bacterium Acinetobacter lwoffii F78 together with a mouse model of experimental allergic airway inflammation, this study investigated the hygiene hypothesis, maternal (prenatal) microbial exposure, and the involvement of Toll-like receptor (TLR) signaling in prenatal protection from asthma. Maternal intranasal exposure to A. lwoffii F78 protected against the development of experimental asthma in the progeny. Maternally, A. lwoffii F78 exposure resulted in a transient increase in lung and serum proinflammatory cytokine production and up-regulation of lung TLR messenger RNA. Conversely, suppression of TLRs was observed in placental tissue. To investigate further, the functional relevance of maternal TLR signaling was tested in TLR2/3/4/7/9−/− knockout mice. The asthma-preventive effect was completely abolished in heterozygous offspring from A. lwoffii F78–treated TLR2/3/4/7/9−/− homozygous mother mice. Furthermore, the mild local and systemic inflammatory response was also absent in these A. lwoffii F78–exposed mothers. These data establish a direct relationship between maternal bacterial exposures, functional maternal TLR signaling, and asthma protection in the progeny

Regulatorische Einflüsse probiotischer Bakterien auf allergische Immunantworten

Unter Allergie wird eine Dysregulation des Immunsystems verstanden, bei der es zu pathologischen immunologischen Reaktionen, wie z.B. Rhinokonjunktiviten, Pruritus oder gar Asthma bronchiale, gegen normalerweise harmlose Antigene kommt. Allergien zählen heute zu den häufigsten und volkswirtschaftlich wichtigsten Erkrankungen Europas, insbesondere auch deshalb, da gerade Kinder und Jugendliche häufig betroffen sind. Es ist also auch von größtem sozioökonomischem Interesse, nach neuen Möglichkeiten zur Prävention und Therapie dieser Erkrankungen zu suchen. Die Forschung beschäftigt sich aktuell unter anderem mit den prä- und frühen postnatalen Einflüssen auf die Entstehung von Allergien. So sollte die vorliegende Arbeit untersuchen, wie eine gezielte Ernährung mit Zellkulturüberständen von Lactobacillus rhamnosus GG (LGGM) während der Schwangerschaft die Toleranzmechanismen gegenüber Allergenen in den Nachkommen beeinflussen kann. Im Mausmodell konnte dabei gezeigt werden, dass bei den Nachkommen der perinatal mit LGGM behandelten Muttertiere einige für allergische Reaktionen in der Lunge typische Charakteristika signifikant vermindert wurden. So wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere peribronchiale Infiltration durch eosinophile Granulozyten beobachtet. Auch konnte eine Abschwächung einer TH2- zugunsten einer stärker TH1 gewichteten Immunantwort aufgezeigt werden. Keine Unterschiede wurden aber bei den Konzentrationen an OVA-spezifischen Immunglobulinen gemessen, sodass insgesamt festzuhalten bleibt, dass eine Therapie mit LGGM zwar die Manifestation einer Allergie abschwächt, die Sensibilisierung als Grundstein in der Pathogenese aber hierdurch nicht verhindert wird. In vitro-Untersuchungen zur Differenzierung therapeutisch wirksamer Bestandteile des LGGM mit einer Makrophagenzelllinie zeigten, dass nicht DNA-Bestandteile, sondern Proteinase-sensible Moleküle für die immunregulatorischen Effekte verantwortlich zu sein scheinen. Im Hinblick auf die Möglichkeit, ein natürliches Pharmakon als Nahrungsergänzung für Schwangere herzustellen, das weitgehend befreit von potentiell pathogen wirksamen Bestandteilen des gesamten Bakteriums sein sollte, bleibt es das Ziel weiterführender Studien zu klären, welche Substanz(en) des LGGM genau für die immunmodulatorisch wirksamen Effekte verantwortlich ist/sind

Funktionelle Charakterisierung und Wirksamkeitsvergleich unterschiedlicher Varianten eines DNAzyms gegen den Transkriptionsfaktor GATA-3

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege, welche durch eine reversible Bronchoobstruktion, bronchiale Hyperreagibilität, Schleimhautödem und erhöhte Mukusproduktion gekennzeichnet ist. Innerhalb der Immunpathogenese einer allergischen Entzündungsreaktion spielt der Transkriptionsfaktor GATA-3 aufgrund seiner Funktion bei der Differenzierung und Aktivierung von Th2-Zellen und der Expression in Eosinophilen, Mastzellen und natürlichen Killer-T-Zellen eine zentrale Rolle und stellt aufgrund dessen ein interessantes therapeutisches Angriffsziel dar. Eine neue Therapiestrategie sind Antisense-Technologien. Sie bieten die Möglichkeit einer frühen therapeutischen Intervention, da sie direkt mit der mRNA der Zielmoleküle interagieren und so die spezifische Inhibierung der Expression eines Gens bewirken können. Zu den wichtigsten Antisense-Strategien gehören unter anderem DNAzyme, RNA-spaltende einzelsträngige Desoxyoligonukleotide. Durch die Möglichkeit, DNAzyme auf unterschiedliche Art zu modifizieren, ergeben sich zusätzlich interessante Möglichkeiten zur Optimierung dieser Antisense-Technologie. In dieser Arbeit wurde das GATA-3-spezifische DNAzym hgd40 mit den Modifizierungen eines inversen Thymidins am 3´-Ende, Phosphothioatverbindungen, 2´-O-Methylgruppen und Locked nucleic acids versehen. Das DNAzym und die entwickelten Varianten wurden funktionell charakterisiert, insbesondere wurde der Einfluss der vorgenommenen Modifikationen auf die Zugänglichkeit gegenüber der Zielsequenz sowie auf die katalytische Effizienz untersucht. Weiterhin wurden die Aktivität in Abhängigkeit des Magnesiummilieus analysiert und die GATA-3-DNAzyme in einem in vitro System hinsichtlich einer Auslösung möglicher Nebenwirkungen überprüft. Analysen zur Spaltungsaktivität ergaben, dass alle entwickelten Varianten außer das mit 2’-O-Methylgruppen versehene hgd40-OMe3 sowie das mit LNA versehene hgd40-L2 die GATA-3-cRNA spalten konnten. Die mit inversem Thymidin am 3´-Ende modifizierte Variante hgd40-3M und die mit LNA versehene Variante hgd40-L3 wiesen eine ähnlich hohe bzw. leicht verbesserte Spaltungseffizienz im Vergleich mit dem unmodifizierten hgd40-DNAzym auf. Hinsichtlich des Magnesiummilieus zeigte sich für alle verwendeten DNAzyme eine hohe Aktivität auch bei physiologischen Magnesiumkonzentrationen, welches auf eine hohe Aktivität in vivo hoffen lässt. Im Hinblick auf mögliche Off-Target-Effekte konnte in Zellkultur-Experimenten ausgeschlossen werden, dass die DNAzym-Varianten eine Aktivierung angeborener Immunmechanismen, insbesondere durch Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor 9, bewirken. Abschließend kann festgestellt werden, dass ein zukünftiger Einsatz eines modifizierten GATA-3-spezifischen hgd40-DNAzyms als neue Therapiestrategie bei Asthma bronchiale vielversprechend erscheint. Dies sollte in weiterführenden Untersuchungen in vivo überprüft werden

Funktionelle Charakterisierung von BAL-Zellen NO2-exponierter Ratten

Makrophagen und neutrophilen Granulozyten sind in der Lage, durch Phagozytose und anschließende Produktion von Radikalen, wie beispielsweise auch Superoxid, pathogene Mikroorganismen zu eliminieren. Da diese Effektorzellen des angeborenen Immunsystems in Lungen von Patienten mit COPD vermehrt vorkommen, wäre im Rahmen dieser Erkrankung ein verbesserter Schutz vor bakteriellen Infektionen zu erwarten. Die Praxis zeigt aber, dass es bei Patienten mit COPD häufig zu einer bakteriell induzierten Exazerbation kommt. Um die diesem Phänomen zugrunde liegenden Mechanismen besser verstehen zu können, bestand die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit in der funktionellen Charakterisierung von BAL-Zellen exponierter Ratten zu unterschiedlichen Zeitpunkten einer NO2 induzierten Entzündung. Hierbei stellten wir die Haupthypothese auf, dass es in BAL-Zellen NO2-exponierter Tiere zu einem Aktivierungswechsel hin zu einer alternativen Aktivierung kommt. In unseren Experimenten legten wir einen Schwerpunkt auf die Untersuchung des Radikal-Stoffwechsels sowie der Zytokinsekretion von BAL-Zellen von Tieren nach unterschiedlich langer NO2 Exposition (24 Stunden, 3 Tage, 20 Tage) im Vergleich zu BAL-Zellen gesunder Kontrolltiere. Wir konnten zeigen, dass die durch Zymosan-Stimulation induzierte Superoxid Produktion in BAL-Zellen von NO2-exponierten Ratten zu allen untersuchten Zeitpunkten der Entzündung signifikant vermindert war. Der Einsatz von Enzyminhibitoren offenbarte, dass die für die Superoxid-Synthese wesentlichen Enzymsysteme, die NADPH-Oxidase sowie der Komplex III der mitochondrialen Atmungskette, durch NO2-Exposition in ihrer Funktion beeinflußt wurden. Bei der Untersuchung der Transskription von im oxidativen/antioxidativen Stoffwechsel beteiligten Enzymen konnten wir zeigen, dass die mRNA einzelner Isoformen der SOD und der GPx nach NO2-Exposition vermehrt exprimiert wurde. Des Weiteren untersuchten wir die Aktivität der antioxidativen Enzyme SOD und GPx in BAL-Zellen mittels Funktionsassays. Hierbei konnten wir nachweisen, dass es in BAL-Zellen von Tieren nach 20-tägiger NO2-Exposition zu einem signifikanten Anstieg der Aktivität beider Enzymsysteme kam. Im Prozess der Infektabwehr und Immunmodulation kommt neben dem Radikalstoffwechsel auch der Sekretion von Zytokinen eine besondere Bedeutung zu. Wir untersuchten, inwieweit das Surfactant Protein-A zu unterschiedlichen Zeitpunkten der NO2-induzierten Entzündung die Zytokinfreisetzung von BAL-Zellen beeinflussen kann. Wir konnten nachweisen, dass die LPS-induzierte TNF-Sekretion der BAL-Zellen von Tieren nach 3 oder 20 Tagen NO2-Exposition im Vergleich zu der von Kontrolltieren signifikant geringer war. SP-A bewirkte in den BAL Zellen nach 20-tägiger NO2 Exposition eine weitere, jedoch nicht signifikante Hemmung der TNF-Sekretion. Bezüglich der Sekretion von IL-10 waren nur Tiere nach 3-tägiger NO2-Exposition zu einer nennenswerten Zytokinfreisetzung in der Lage. Die SP-A-Zugabe führte in der Tendenz zu einer verstärkten Sekretion dieses antiinflammatorischen Zytokins. Die Sekretion des Chemokins MCP-1 der BAL-Zellen wurde durch NO2 Exposition in den einzelnen Phasen der induzierten Entzündung unterschiedlich beeinflusst. Die Zugabe von SP-A führte hingegen zu einer einheitlichen Suppression der Freisetzung des proinflammatorischen Chemokins unabhängig von einer vorherigen NO2 Exposition der Versuchstiere. Zusammenfassend zeigten unsere Untersuchungen, dass BAL-Zellen im Rahmen einer NO2-induzierten Entzündung einen Aktivierungswechsel hin zu einer alternativen Aktivierung vollziehen. Hierbei sind insbesondere die Veränderungen des Radikalstoffwechsels zu nennen. Dieser Aktivierungswechsel könnte in unserem Tiermodell als autoprotektiver Mechanismus im durch NO2-induzierten Inflammationsprozess gedeutet werden. Ein Überwiegen von alternativ aktivierten BAL-Zellen mit verminderter Radikalfreisetzung jedoch unterstützt eine erhöhte Infektanfälligkeit, was eine mögliche Erklärung für das gehäufte Vorkommen von Infektexazerbationen im Rahmen einer COPD darstellen könnte