Fingerprint of the mitochondrial ABC transporter Mdl1p from Saccharomyces cerevisiae

The multidrug resistance like protein 1 (Mdl1p) belongs to the class of ATP binding cassette (ABC) transporters which comprise a large family of membrane proteins utilising ATP hydrolysis to drive up-hill transport of a wide variety of solutes across membranes. Mdl1p is a mitochondrial ABC transporter involved in the export of protein fragments derived from the proteolysis of non-assembled inner membrane proteins out of the mitochondrial matrix. Mdl1p forms a homodimeric complex consisting of two polytrophic transmembrane domains (TMDs) and two nucleotide binding domains (NBDs). The transport function and structural organisation of Mdl1p have not been elucidated yet. To characterise the ATP hydrolysis cycle of Mdl1p, the His-tagged NBD (amino acids D423-R695) was over-expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis. The ATPase activity was non-linear regarding to the protein concentration, indicating that the functional state is a dimer. Dimeric catalytic transition states could be trapped and three different intermediate states were isolated, containing two ATPs, one ATP and one ADP, or two DPs, which are trapped by orthovanadate or beryllium fluoride. These experiments showed that (i) ATP binding to the NBDs induces dimerisation, (ii) in all isolated dimeric states, two nucleotides are present, (iii) phosphate can dissociate from the dimer, (iv) both nucleotides are hydrolysed, and (v) hydrolysis occurs in a sequential mode. Studies in the workgroup systematically screened for over-expression of the full-length Mdl1p and expression conditions were optimised. These studies showed that highest expression was obtained in S. cerevisiae, where the protein was over-expressed 100-fold. In this work over-expressed His-tagged protein was purified via immobilised metal-ion affinity chromatography that was active in ATP binding and hydrolysis with a turn-over of 2.5 ATP per second. N-terminal amino acid sequencing of purified Mdl1p by Edman degradation confirmed experimentally a N-terminal targeting sequence of a mitochondrial ABC transporter of S. cerevisiae for the first time. This sequence was determined to be 59 amino acids in length. Mdl1p was reconstituted into liposomes, which was confirmed by freeze fracture electron microscopy. The reconstituted protein showed ATP hydrolysis similar to the solubilised Mdl1p. However peptide translocation with radiolabelled X(8) or X(23) libraries as done for the transporter associated with antigen processing TAP could not be shown with this setup. Furthermore, structural insights of the mitochondrial transport complex and its oligomeric state were obtained via single particle electron microscopy. It was shown that Mdl1p forms a homodimer in detergent. These in vitro studies provide the basis for further detailed investigation of the mitochondrial ABC transporter Mdl1p.Die Ausbildung biologischer Membranen und die daraus resultierende Abgrenzung von speziellen Reaktionskompartimenten stellen einen entscheidenden Schritt in der Evolution des Lebens dar. Dabei sind Membranen allerdings keine unpassierbaren Mauern, sondern hochselektiv permeable Diffusionsbarrieren. Dies wird durch das Vorhandensein von spezifischen molekularen Kanälen und Pumpen bewerkstelligt. Der Transport von Molekülen über Membranen stellt einen vektoriellen Prozess dar, der den Stoffaustausch und die Kommunikation der einzelnen Kompartimente untereinander sowie mit der Umgebung ermöglicht. Eine Gruppe von Membranpumpen stellt die Familie der „ATP binding cassette“ (ABC) Transporter dar, eine der größten Familien paraloger Proteine, die die aktive Beförderung unterschiedlichster Substanzen über biologische Membranen ausführt. Vertreter dieser Superfamilie finden sich in allen bekannten Organismen von Bakterien bis hin zu Säugern und nehmen an einer Vielzahl von zellulären Prozessen teil. Sie sind an der Nährstoffaufnahme, dem Lipidtransport, an der Ionen- und Osmolyt-Homöostase sowie an der Antigenprozessierung beteiligt. Unter Verbrauch von ATP transportieren sie gegen einen Konzentrationsgradienten eine Fülle von chemischen Stoffen, wie z. B. Kohlenhydrate, Peptide, Proteine, Steroide, Antibiotika, Metallionen sowie ein breites Spektrum an hydrophoben Substanzen. Neben der Transportaktivität können diese Proteine eine Funktion als Ionenkanäle, Regulatoren von Kanälen oder Rezeptoren haben. Einige Vertreter weisen eine hohe klinische Relevanz auf. Beispielsweise ist die Mutation des ABC Transporters CFTR die molekulare Grundlage für die Entstehung der cystischen Fibrose. Andere Vertreter dieser Proteinfamilie sind an dem Phänomen der Resistenzentwicklung verschiedener Gewebe während chemotherapeutischer Behandlungen beteiligt. Ihre Überexpression stellt ein ernstzunehmendes Problem bei der Behandlung von Tumoren und AIDS dar. Demzufolge ist die Aufklärung der Struktur und Funktionsweise dieser Molekülklasse von zentraler Bedeutung. Die Architektur von ABC Transportern ist trotz der Diversität der zu transportierenden Substrate sehr ähnlich. Typischerweise besteht ein ABC Transporter aus vier Domänen: zwei Transmembrandomänen (TMD) und zwei Nukleotidbindungsdomänen (NBD). Definiert wird die Proteinfamilie durch die Homologie innerhalb der NBDs, welche die konservierten Sequenzabschnitte Walker A und B sowie die für ABC Proteine spezifische C-Schleife beinhalten. Die NBDs gelten als die Motordomänen von ABC Transportern, die ATP hydrolysieren und dadurch die für den Transport benötigte Energie zur Verfügung stellen. Die Anordnung der Domänen ist variabel. Bei Prokaryonten werden vornehmlich alle vier Domänen einzeln translatiert. Hier kommt häufig ein periplasmatisches Bindungsprotein mit hoher Substrataffinität vor, das mit dem jeweiligen Transporter assoziiert ist. Eukaryontische ABC Transporter existieren als „Volltransporter“ bestehend aus einer Polypeptidkette mit je zwei TMDs und zwei NBDs oder auch als „Halbtransporter“ wie beispielsweise der ABC Transporter Mdl1p (multidrug resistance like protein 1) mit jeweils einer TMD und einer NBD pro Genprodukt. Der Transportmechanismus, die Energetisierung sowie das strukturelle Zusammenspiel der verschiedenen Domänen innerhalb dieser Membranproteinkomplexe sind bisher größtenteils unverstanden. Auch die (physiologisch relevanten) Substrate vieler ABC Proteine sind zumeist nicht identifiziert. In dieser Arbeit wird der ABC Transportkomplex dl1p der inneren Mitochondrienmembran von Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem funktionell und strukturell charakterisiert. Dabei soll die Tatsache nicht unerwähnt bleiben, dass die Bäckerhefe aufgrund leichter genetischer Manipulierbarkeit und schneller Produktion von Biomasse einen idealen Modellorganismus darstellt. Mdl1p spielt eine wichtige Rolle bei der Mitochondrienbiogenese, da es für den Export von Degradationsprodukten, wie z.B. falsch assemblierter Untereinheiten der Atmungskette, verantwortlich ist. Die innere Mitochondrienmembran ist neben der inneren Chloroplastenmembran die einzige zelluläre Membran, die nicht direkt mit dem Cytosol in Kontakt tritt und folglich nicht der Qualitätskontrolle durch das Ubiquitin/Proteasomsystem unterliegt. Daher verfügen Mitochondrien über eine autonome, ATP abhängige Qualitätskontrolle, die durch einen proteolytischen Multienzymkomplex vermittelt wird. Die AAA Proteasen (ATPase associated with a variety of cellular activities) sind für den Abbau von falsch gefalteten Proteinen der inneren Mitochondrienmembran verantwortlich. Mdl1p exportiert vermutlich die dabei entstandenen Peptide aus der Matrix in den Intermembranraum des Mitochondriums. Aufgrund seines modulartigen Aufbaus kann der ABC Transporter Mdl1p in seine Nterminale TMD und C-terminale NBD unterteilt werden. Die lösliche NBD (Aminosäuren D423 bis R695) wurde in Escherichia coli überexprimiert und über eine Affinitätsschleife zur Homogenität gereinigt. Die Aktivität des Proteins bezüglich ATP Bindung und Hydrolyse bleibt dabei erhalten. Interessanterweise ist die ATP Hydrolyse nicht linear von der Proteinkonzentration abhängig wie bei Arbeiten in der Arbeitsgruppe gezeigt wurde. Diese Beobachtung lässt auf einen nicht monomeren Zwischenzustand im ATPase Zyklus schließen. Tatsächlich kann in dieser Arbeit mittels der ATPase Inhibitoren ortho-Vanadat (Vi) und Berylliumfluorid (BeFx) ein wild-typ-NBD-Dimer in Gelfiltrationsläufen beobachtet werden. Das Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer ist dabei strikt abhängig von der eingesetzten Inhibitorkonzentration. Ortho-Vanadat und BeFx stellen Analoga des anorganischen Phosphates dar. Sie arretieren einen Enzymzustand während der ATP Hydrolyse, in dem das ADP Molekül in der Bindungstasche verbleibt, während das Phosphat bereits dissoziert ist. Eine Stöchiometriebestimmung mit radioaktiv markiertem ATP ergab, dass das Dimer mit zwei Nukleotiden beladen ist und beide hydrolysiert sind. Die Mutation des Glutamats 599 (E599) stromabwärts des Walker B Motivs zu einem Glutamin (Q) führt zu einer NBD mit stark verringerter ATPase-Aktivität. Dieses Glutamat ist innerhalb der Familie der ABC Transporter hoch konserviert und seine Funktion während des Hydrolyseprozesses wird in der Literatur kontrovers diskutiert. In allen beschriebenen Fällen gilt diese Mutante jedoch als hydrolyse- bzw. transportdefizient. Die Mdl1p-NBD-Mutante bildet in Gegenwart von ATP ein stabiles Dimer. Stöchiometrieuntersuchungen an dem E599Q-NBD-Dimer zeigen, dass zwei Nukleotide inkorporiert sind. Nach einer Inkubation unter „Nicht-Hydrolysebedingungen“ (4 °C, ohne Mg2+) bleiben zwei ATP Moleküle im Dimer erhalten. Wird die NBD jedoch bei 30 °C in Gegenwart von Mg2+ inkubiert, kann ein Dimer isoliert werden, in dem ein ATP und ein ADP detektierbar ist. Auch nach einer Inkubation über mehrere Stunden, kann kein Dimer mit zwei ADP Molekülen erhalten werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass zumindest ein ATP-Molekül zur Erhaltung des Dimers erforderlich ist. Hydrolyse beider Nukleotide führt zur Dissoziation des Komplexes. Basierend auf diesen Ergebnissen kann ein Modell für die ATP Hydrolyse erstellt werden, in dem die Bindung der Nukleotide an die monomeren Untereinheiten eine Assoziation der NBDs induziert. Zwei ATP-Moleküle werden sequentiell hydrolysiert, bevor das Dimer mit gebundenen ADP-Molekülen dissoziert. Bei Arbeiten in der Arbeitsgruppe wird innerhalb eines systematischen Ansatzes die Überexpression von Mdl1p als Gesamtprotein etabliert. Dazu kommen als prokaryontische Expressionssysteme das gram-negative Bakterium Escherichia coli und das gram-positive Bakterium Lactococcus lactis zum Einsatz. Weiterhin wird der homologe eukaryontische Expressionswirt Sacharomyces cerevisiae verwendet. Das MDL1-Gen konnte durch das Einführen einer neuen und die Nutzung einer vorhandenen Restriktionschnittstelle in drei Kassetten unterteilt werden, die eine weitere genetische Manipulation und Klonierung deutlich vereinfachen. So werden Kassetten mit und ohne N-terminaler mitochondrialer Leitsequenz und verschiedenen Affinitätsschleifen konstruiert. Zu Zwecken detaillierter Untersuchung des Gesamttransporters wurde die schon von der NBD bekannte Mutante E599Q als auch die bei anderen ABC Transportern als ATP-hydrolyseinaktiv bekannte Mutation des konservierten Histidins (H631) der H-Schleife zu einem Alanin generiert (H631 -> A). Ergebnis dieser Arbeiten war, dass in E. coli im besten Fall 0,005 % Mdl1p (bezogen auf die Gesamtmembranproteinmenge) erzielt wurde, was deutlich unter der erwarteten und für weitere Experimente erforderlichen Expressionsausbeute lag. Dabei wurde das Protein in verschiedene „high-“ und „low-copy“ Vektoren mit unterschiedlichen Promotoren wie z. B. T7 (IPTG-induziert), ARA (Arabinose-induziert) oder TRC (IPTG-induziert) kloniert. Weiterhin wurde die Expression in verschiedenen E. coli-Stämmen bei verschiedenen Wachstumstemperaturen getestet. Auch die Konzentration der Induktoren wie IPTG oder Arabinose und der Zeitpunkt sowie die Dauer der Induktion wurden systematisch variiert. Schließlich wurde Mdl1p zusammen mit der “Membraninsertionsmaschinerie” SecY, SecE, SecG und YidC und in Stämmen, die seltene tRNAs codieren, exprimiert. Um das Translationsprodukt möglicherweise besser vor degenerativen Prozessen innerhalb der Zelle zu schützen, werden diese mit höheren Konzentrationen Ethanol oder Sorbitol im Medium kultiviert, mit dem Ziel, auf diese Weise Chaperone zu induzieren. Die Expression wurde jeweils durch quantitativen Westerntransfer mit anschließender Immundetektion unter der Verwendung der Mdl1p-NBD als Referenz evaluiert. Ähnlich niedrige Ausbeuten von 0,01 % Mdl1p werden in L. lactis erzielt, wobei analoge Variationen der Expressionsbedingungen, wie für E. coli beschrieben, durchgeführt wurden. In beiden Ansätzen stellen die erhaltenen Mengen keine Verbesserung der Ausbeute im Vergleich zum homologen Expressionssystem dar. Wie im Rahmen der Arbeiten zur Überexpression von Mdl1p bestimmt wurde, wird Mdl1p in S. cerevisiae bis zu 0,01 % des totalen mitochondrialen Membranproteingehalts exprimiert. Um die Mdl1p-Menge zu erhöhen, wurden in der Arbeitsgruppe verschiedene Ansätze getestet, wie beispielsweise die plasmidgetriebene, starke und konstitutive Expression über einen GPD-Promotor (Glycerolphosphatdehydrogenase). Interessanterweise wird in diesem Fall weniger Protein erhalten als bei einer wildtyp-Expression. Dies legte die Vermutung nahe, dass hohe Mengen Mdl1p von der Zelle nicht toleriert werden können. Grosse Mengen Mdl1p wurden letztlich nur über einen GAL1-Promotor (Galaktose induzierbar) auf einem 2µ-Plasmid erreicht. Über die His(8)-Schleife am C-Terminus des Proteins und der Verwendung der Metall-Affinitätschromatographie gelang im Rahmen dieser Arbeit die Isolierung von Mdl1p bis zu einer Homogenität von 95 %. Dabei wurde ein breites Spektrum an nicht-, einfach- und zwitterionischen Detergenzien zur Solubilisierung verwendet. Hier zeigen sich zwei wichtige Aspekte: Erstens solubilisieren unterschiedliche Detergenzien Mdl1p in sehr unterschiedlichem Ausmaß. Mit dem Detergenz Tetradecylphosphocholine (FC-14) kann beispielsweise bis zu 1 mg Protein pro Liter Hefekultur präpariert werden. Bei den Detergenzien Dodecylmaltosid (DDM) und Digitonin sind die Ausbeuten reduziert und belaufen sich auf 0,2 bzw. 0,1 mg pro Liter Zellkultur. Zweitens wird auch die Hydrolyseaktivität des gereinigten Proteins stark durch das Detergenz beeinflusst. So zeigt Mdl1p seine höchste Geschwindigkeit in Digitonin während in DDM nur noch ein Drittel der Geschwindigkeit detektiert werden kann. In FC-14 ist keine Hydrolysetätigkeit mehr vorhanden. Daher wurden alle Experimente mit Protein durchgeführt, das in Anwesenheit von Digitonin gereinigt wurde. Das solubilisierte Protein bindet ATP wie durch 8-azido-[alpha-32P]ATP-photocross-linking-Experimente gezeigt wurde und besitzt eine Hydrolyseaktivität mit einem KM(ATP) von 0,85 mM und einer Wechselzahl von 2,5 ATP pro Sekunde. Die beiden Mutanten (E599Q, H631A), die in gleicher Weise und Menge exprimiert und präpariert werden können wie das Wildtyp-Protein, sind zwar in der Lage ATP zu binden, nicht jedoch es zu hydrolysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wird weiterhin die Existenz einer N-terminalen Leitsequenz von Mdl1p ermittelt und näher charakterisiert. In der Literatur werden spezifische Signalsequenzen diskutiert, die eine eindeutige Adressierung und einen Transport von Proteinen an ihren Einsatzort in den verschiedenen Zellorganellen gewährleisten. Für mitochondriale Proteine werden sowohl N-terminale Leitsequenzen unterschiedlicher Länge (bis zu 105 Aminosäuren) als auch interne, in der Proteinfaltung verschlüsselte, Leitstrukturen beschrieben. Auch für Mdl1p werden mittels computerbasierter Methoden („in silico“) verschiedene Sequenzen vorhergesagt. Daher soll die Frage nach Art und Länge der Zielsequenz für Mdl1p experimentell beantworten werden. Dazu wird das Protein über die His(8)-Schleife aus Mitochondrien präpariert und mittels N-terminalem Edman-Abbau analysiert. Da die ersten 7 Aminosäuren sequenziert werden, kann eine eindeutige Alignierung der erhaltenen Sequenz mit der Gesamt-Mdl1p-Sequenz erreicht werden. An Hand dieser Daten kann erstmals für einen mitochondrialen ABC Transporter aus Hefe experimentell eine N-terminale Leitsequenz gezeigt werden, die im Fall von Mdl1p 59 Aminosäuren beträgt. Mdl1p kann in Liposomen rekonstituiert werden, was in Zusammenarbeit mit dem Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden konnte. Hierbei blieb die ATP Hydrolysefähigkeit von Mdl1p nahezu erhalten, was den Einsatz von Proteoliposomen für Importstudien ermöglicht. Ein Peptidtransport mit radioaktiv markierten Peptidbibliotheken einer Länge von 8 bzw. 23 Aminosäuren (dabei enthalten die Peptide alle proteinogenen Aminosäuren in gleichem Verhältnis mit Ausnahme von Cystein) konnte mit diesem System allerdings nicht gezeigt werden. Gründe für diese Ergebnisse werden in dieser Arbeit ausführlich diskutiert, was zu einer Neubewertung der Rolle von Mdl1p als Peptidetransporter führt. Das solubilisierte Protein wurde in einer Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt mittels Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie untersucht, was Einsichten in den oligomeren und strukturellen Aufbau des Proteins ermöglicht. Dabei werden die Einzelpartikel zu einer dreidimensionalen Ansicht rekonstruiert und mit den Kristallstrukturen des ABC Transporters MsbA verglichen. Diese zeigen MsbA in zwei sehr unterschiedlichen Konformationen, eine offene und eine geschlossene Form. Die Dimensionen der Partikel von Mdl1p kommen hierbei der offenen Form non MsbA am nächsten. Dabei wird auch deutlich, dass Mdl1p in Detergenz sehr wahrscheinlich als Homodimer vorliegt. Die vorliegende Arbeit mit ihren in vitro Studien zeigt zum ersten Mal eine Art „Fingerabdruck“ des mitochondrialen ABC Transporters Mdl1p aus S. cerevisiae und stellt damit eine Basis für detaillierte Untersuchungen dieses Proteins dar

Improved systematic tRNA gene annotation allows new insights into the evolution of mitochondrial tRNA structures and into the mechanisms of mitochondrial genome rearrangements

Transfer RNAs (tRNAs) are present in all types of cells as well as in organelles. tRNAs of animal mitochondria show a low level of primary sequence conservation and exhibit ‘bizarre’ secondary structures, lacking complete domains of the common cloverleaf. Such sequences are hard to detect and hence frequently missed in computational analyses and mitochondrial genome annotation. Here, we introduce an automatic annotation procedure for mitochondrial tRNA genes in Metazoa based on sequence and structural information in manually curated covariance models. The method, applied to re-annotate 1876 available metazoan mitochondrial RefSeq genomes, allows to distinguish between remaining functional genes and degrading ‘pseudogenes’, even at early stages of divergence. The subsequent analysis of a comprehensive set of mitochondrial tRNA genes gives new insights into the evolution of structures of mitochondrial tRNA sequences as well as into the mechanisms of genome rearrangements. We find frequent losses of tRNA genes concentrated in basal Metazoa, frequent independent losses of individual parts of tRNA genes, particularly in Arthropoda, and wide-spread conserved overlaps of tRNAs in opposite reading direction. Direct evidence for several recent Tandem Duplication-Random Loss events is gained, demonstrating that this mechanism has an impact on the appearance of new mitochondrial gene orders

The Challenge of Regulation in a Minimal Photoautotroph: Non-Coding RNAs in Prochlorococcus

Prochlorococcus, an extremely small cyanobacterium that is very abundant in the world's oceans, has a very streamlined genome. On average, these cells have about 2,000 genes and very few regulatory proteins. The limited capability of regulation is thought to be a result of selection imposed by a relatively stable environment in combination with a very small genome. Furthermore, only ten non-coding RNAs (ncRNAs), which play crucial regulatory roles in all forms of life, have been described in Prochlorococcus. Most strains also lack the RNA chaperone Hfq, raising the question of how important this mode of regulation is for these cells. To explore this question, we examined the transcription of intergenic regions of Prochlorococcus MED4 cells subjected to a number of different stress conditions: changes in light qualities and quantities, phage infection, or phosphorus starvation. Analysis of Affymetrix microarray expression data from intergenic regions revealed 276 novel transcriptional units. Among these were 12 new ncRNAs, 24 antisense RNAs (asRNAs), as well as 113 short mRNAs. Two additional ncRNAs were identified by homology, and all 14 new ncRNAs were independently verified by Northern hybridization and 5′RACE. Unlike its reduced suite of regulatory proteins, the number of ncRNAs relative to genome size in Prochlorococcus is comparable to that found in other bacteria, suggesting that RNA regulators likely play a major role in regulation in this group. Moreover, the ncRNAs are concentrated in previously identified genomic islands, which carry genes of significance to the ecology of this organism, many of which are not of cyanobacterial origin. Expression profiles of some of these ncRNAs suggest involvement in light stress adaptation and/or the response to phage infection consistent with their location in the hypervariable genomic islands

Primary relaxation in a hard-sphere system

The a-relaxation dynamics in a hard-sphere system is studied solving microscopic-mode-coupling equations. The solutions for coherent and incoherent dynamical structures factors, the transversal correlation functions, and the modili are presented for all wave vectors. The wave-vector dependence of fitted Kohlrausch exponents ß and of the relaxation times t is discussed. Recent experiments on the a relaxation of colloidal systems are quantitatively analyzed

Comments on the alpha-peak shapes for relaxation in supercooled liquids

The alpha-peak master functions as obtained within the mode coupling theory for the supercooled liquid dynamics near the glass transition singularity are discussed. Double peak phenomena are found as a generic feature of the theory related to the self crossing of the transition hypersurface. They lead to two scenarios for liquid to glass transitions characterized by alpha'-alpha-peak pairs and by alpha-resonances accompanied by y-peaks. An efficient numerical procedure is developed for the so lution of the non-linear scaling equations for the master functions. A schematic three component model is used to fit quantitatively the dielectric loss spectra of polyvinylacetate, ortho-terphenyl, CaKNO3 and poly propylene glycol, which all deviate strongly from the Kohlrausch decay pattern. The model yields also triple resonances of alpha-gamma-delta-peaks

The ATP hydrolysis cycle of the nucleotide-binding domain of the mitochondrial ATP-binding cassette transporter Mdl1p

The ABC transporter Mdl1p, a structural and functional homologue of the transporter associated with antigen processing (TAP) plays an important role in intracellular peptide transport from the mitochondrial matrix of Saccharomyces cerevisiae. To characterize the ATP hydrolysis cycle of Mdl1p, the nucleotide-binding domain (NBD) was overexpressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis with a turnover of 25 ATP per minute and a Km of 0.6 mm and did not show cooperativity in ATPase activity. However, the ATPase activity was non-linearly dependent on protein concentration (Hill coefficient of 1.7), indicating that the functional state is a dimer. Dimeric catalytic transition states could be trapped either by incubation with orthovanadate or beryllium fluoride, or by mutagenesis of the NBD. The nucleotide composition of trapped intermediate states was determined using [alpha-32P]ATP and [gamma-32P]ATP. Three different dimeric intermediate states were isolated, containing either two ATPs, one ATP and one ADP, or two ADPs. Based on these experiments, it was shown that: (i) ATP binding to two NBDs induces dimerization, (ii) in all isolated dimeric states, two nucleotides are present, (iii) phosphate can dissociate from the dimer, (iv) both nucleotides are hydrolyzed, and (v) hydrolysis occurs in a sequential mode. Based on these data, we propose a processive-clamp model for the catalytic cycle in which association and dissociation of the NBDs depends on the status of bound nucleotides

Structural and functional fingerprint of the mitochondrial ATP-binding cassette transporter Mdl1 from Saccharomyces cerevisiae

The ATP-binding cassette half-transporter Mdl1 from Saccharomyces cerevisiae has been proposed to be involved in the quality control of misassembled respiratory chain complexes by exporting degradation products generated by the m-AAA proteases from the matrix. Direct functional or structural data of the transport complex are, however, not known so far. After screening expression in various hosts, Mdl1 was overexpressed 100-fold to 1% of total mitochondrial membrane protein in S. cerevisiae. Based on detergent screens, Mdl1 was solubilized and purified to homogeneity. Mdl1 showed a high binding affinity for MgATP (Kd = 0.26 μm) and an ATPase activity with a Km of 0.86 mm (Hill coefficient of 0.98) and a turnover rate of 2.6 ATP/s. Mutagenesis of the conserved glutamate downstream of the Walker B motif (E599Q) or the conserved histidine of the H-loop (H631A) abolished ATP hydrolysis, whereas ATP binding was not affected. Mdl1 reconstituted into liposomes showed an ATPase activity similar to the solubilized complex. By single particle electron microscopy, a first three-dimensional structure of the mitochondrial ATP-binding cassette transporter was derived at 2.3-nm resolution, revealing a homodimeric complex in an open conformation

Next-generation sequencing of the Chinese hamster ovary microRNA transcriptome: Identification, annotation and profiling of microRNAs as targets for cellular engineering

Hackl M, Jakobi T, Blom J, et al. Next-generation sequencing of the Chinese hamster ovary microRNA transcriptome: Identification, annotation and profiling of microRNAs as targets for cellular engineering. Journal of Biotechnology. 2011;153(1-2):62-75.Chinese hamster ovary (CHO) cells are the predominant cell factory for the production of recombinant therapeutic proteins. Nevertheless, the lack in publicly available sequence information is severely limiting advances in CHO cell biology, including the exploration of microRNAs (miRNA) as tools for CHO cell characterization and engineering. In an effort to identify and annotate both conserved and novel CHO miRNAs in the absence of a Chinese hamster genome, we deep-sequenced small RNA fractions of 6 biotechnologically relevant cell lines and mapped the resulting reads to an artificial reference sequence consisting of all known miRNA hairpins. Read alignment patterns and read count ratios of 5' and 3' mature miRNAs were obtained and used for an independent classification into miR/miR* and 5p/3p miRNA pairs and discrimination of miRNAs from other non-coding RNAs, resulting in the annotation of 387 mature CHO miRNAs. The quantitative content of next-generation sequencing data was analyzed and confirmed using qPCR, to find that miRNAs are markers of cell status. Finally, cDNA sequencing of 26 validated targets of miR-17-92 suggests conserved functions for miRNAs in CHO cells, which together with the now publicly available sequence information sets the stage for developing novel RNAi tools for CHO cell engineering

Progressive multiple sequence alignments from triplets

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The quality of progressive sequence alignments strongly depends on the accuracy of the individual pairwise alignment steps since gaps that are introduced at one step cannot be removed at later aggregation steps. Adjacent insertions and deletions necessarily appear in arbitrary order in pairwise alignments and hence form an unavoidable source of errors.</p> <p>Research</p> <p>Here we present a modified variant of progressive sequence alignments that addresses both issues. Instead of pairwise alignments we use exact dynamic programming to align sequence or profile triples. This avoids a large fractions of the ambiguities arising in pairwise alignments. In the subsequent aggregation steps we follow the logic of the Neighbor-Net algorithm, which constructs a phylogenetic network by step-wisely replacing triples by pairs instead of combining pairs to singletons. To this end the three-way alignments are subdivided into two partial alignments, at which stage all-gap columns are naturally removed. This alleviates the "once a gap, always a gap" problem of progressive alignment procedures.</p> <p>Conclusion</p> <p>The three-way Neighbor-Net based alignment program aln3nn is shown to compare favorably on both protein sequences and nucleic acids sequences to other progressive alignment tools. In the latter case one easily can include scoring terms that consider secondary structure features. Overall, the quality of resulting alignments in general exceeds that of clustalw or other multiple alignments tools even though our software does not included heuristics for context dependent (mis)match scores.</p