Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira

International audienceLeptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, which also includes free-living saprophyte strains. Many aspects of leptospiral basic biology and virulence mechanisms remain unexplored mainly due to the lack of effective genetic tools available for these bacteria. Recently, the type II CRISPR/Cas system from Streptococcus pyogenes has been widely used as an efficient genome engineering tool in bacteria by inducing double-strand breaks (DSBs) in the desired genomic targets caused by an RNA-guided DNA endonuclease called Cas9, and the DSB repair associated machinery. In the present work, plasmids expressing heterologous S. pyogenes Cas9 in L. biflexa cells were generated, and the enzyme could be expressed with no apparent toxicity to leptospiral cells. However, L. biflexa cells were unable to repair RNA-guided Cas9-induced DSBs. Thus, we used a catalytically dead Cas9 (dCas9) to obtain gene silencing rather than disruption, in a strategy called CRISPR interference (CRISPRi). We demonstrated complete gene silencing in L. biflexa cells when both dCas9 and single-guide RNA (sgRNA) targeting the coding strand of the β-galactosidase gene were expressed simultaneously. Furthermore, when the system was applied for silencing the dnaK gene, no colonies were recovered, indicating that DnaK protein is essential in Leptospira. In addition, flagellar motor switch FliG gene silencing resulted in reduced bacterial motility. To the best of our knowledge, this is the first work applying the CRISPRi system in Leptospira and spirochetes in general, expanding the tools available for understanding leptospiral biology

Staphylococcus pseudintermedius multirresistente isolado do cão: relato de caso

The zoonotic potential of multidrug resistant (MDR) bacteria is a worldwide concern and companion animals have been implicated in the spread of resistant bacteria. Therefore, surveillance is important, as there are reports of transmission of these bacteria from dog to men, as well as from men to dog. A 5-year-old mixed-breed male dog was admitted with obstructive struvite urolithiasis relapsing for over 18 months, in Botucatu, in the state of São Paulo, Brazil. The strain, biochemically identified as Staphylococcus spp., was MDR and was treated off-label with vancomycin, which resulted in clinical cure. The strain was molecularly identified as Staphylococcus pseudintermedius and the mecA gene was identified. This is the main gene responsible for methicillin-resistant S. pseudintermedius (MRSP), which is often resistant to multiple antimicrobials. The hypotheses for this clinical case are the transmission from man to animal, since the tutor was an intensivist doctor, or the bacterium itself could be part of the animal’s microbiota and due to other factors, such as stress or obstructive urinary disease, opened a doorway to infection by S. pseudintermedius. Further studies should elucidate the transmission of MDR bacteria between human and pets.O potencial zoonótico de bactérias multirresistentes é uma preocupação global e os animais de companhia têm sido implicados na disseminação de bactérias resistentes; assim, é importante a vigilância, pois já existem relatos de transmissão destas bactérias do cão para o homem e vice-versa. Um cão, sem raça definida e de cinco anos de idade, foi atendido na cidade de Botucatu, São Paulo, Brasil, apresentando urolitíase obstrutiva de estruvita recorrente há um ano e meio. Na urocultura do animal foi isolada uma estirpe de Staphylococcus spp. multirresistente; o tratamento com vancomicina possibilitou acura clínica. A estirpe de Staphylococcus spp. isolada foi identificada molecularmente como S. pseudintermedius e nela foi identificada a presença do gene mecA, o principal responsável por S. pseuidintermedius resistente à meticilina (MRSP), e que é frequentemente resistente à múltiplos antimicrobianos. As hipóteses para este caso clínico são a transmissão do homem para o animal, pois o tutor era um médico intensivista, ou que a própria bactéria fazia parte da microbiota do animal e, devido a outros fatores como estresse e doença urinária obstrutiva, abriu-se uma porta de entrada para a infecção pelo S. pseudintermedius. Mais estudos são necessários para a elucidação da transmissão de bactérias multirresistentes entre animais de companhia e o ser humano

Detecção de Leptospira spp. através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) em sêmen bovino experimentalmente contaminado

Considerando a importância do sêmen na transmissão da leptospira bovina, foi realizado o presente estudo que teve como objetivo aplicar a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para a detecção de leptospiras em sêmen bovino experimentalmente contaminado. A reação de PCR foi capaz de amplificar um fragmento de DNA específico de 330 pares de bases a partir de cultivos puros de 26 sorovares de Leptospira spp. A contaminação experimental de sêmen com Leptospira interrogans serovar hardjo revelou que a técnica de PCR conseguiu detectar 10 bactérias/ml, concentração sensivelmente mais baixa que as 1.000 bactérias/ml detectadas através do cultivo microbiológico. Os resultados observados revelam o grande potencial da reação de PCR para a detecção de Leptospira spp. em sêmen bovino, notadamente em centrais de inseminação artificial.Due to the high importance of the venereal transmission of bovine leptospirosis, this study aimed to test the ability of PCR to detect Leptospira interrogans serovar hardjo DNA in experimentally contaminated bovine semen. Employing primers directed to the 16S rRNA gene, 10 bacteria/ml of semen could be detected by PCR. Results achieved in this work show that PCR can have a great potential to detect Leptospira spp. in insemination centers

Factors affecting meat texture from Nellore and crossbreed Limousin-Nellore steers

O objetivo deste trabalho foi avaliar fatores que influenciam a textura da carne de novilhos Nelore e cruzados Limousin-Nelore. Cinqüenta novilhos, 25 Nelore e 25 Limousin-Nelore, foram aleatoriamente divididos em cinco grupos de 10 animais (cinco de cada grupo genético), para o abate seriado, até 204 dias. Os valores de temperatura e pH muscular foram monitorados durante 24 horas após o abate. Em seguida, foram medidas a espessura de cobertura de gordura e a área de olho de lombo. O músculo longissimus dorsi retirado foi dividido para avaliação qualitativa do músculo sem maturação e submetido à maturação por 14 dias. A área de olho de lombo foi maior em animais cruzados. Os valores de cobertura de gordura e gordura intramuscular foram semelhantes entre os grupos genéticos. Peso ao abate e teor de gordura afetaram as quedas de pH e temperatura, mas não resultaram em diferenças na força de cisalhamento. Os animais cruzados apresentaram carne mais macia que os animais Nelore. A maturação causou redução de 30% na força de cisalhamento e foi, com o fator genético, o parâmetro que mais influenciou a textura da carne.The objective of this work was to evaluate factors affecting meat texture from Nellore and crossbreed Limousin-Nellore steers. Fifty steers, 25 Nellore and 25 Limousin-Nellore, were randomly divided in five groups of 10 animals (five from each genetic group) and serially slaughtered during 204 days. Meat temperature and pH data were monitored during 24 hours post mortem. After this, fat thickness and rib area were measured. Longissimus dorsi muscle was removed to quality evaluation before and after 14 days ageing period. Crossbreed animals rib areas were higher. Fat thickness and marbling values from both genetic groups were similar. Live slaughter weight and fat content affected decrease of pH and temperature, but didn't result in difference in shear force. Crossbreed animals the most tender meat. Ageing process was responsible for 30% reduction in shear force, so this was, associated to genetic group, was the principal factor affecting meat texture

Use of serological diagnostic techniques in the control and eradication of caprine arthritis encephalitis: an update

A artrite encefalite caprina (CAE) é uma enfermidade crônica causada por um lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), que ocasiona perdas significativas na caprinocultura. O estado real da infecção animal pelo LVPR é de difícil determinação em virtude da complexa patogenia do vírus, incluindo fatores como soroconversão tardia ou intermitente em testes sorológicos. Para o diagnóstico da enfermidade, diversas técnicas sorológicas estão disponíveis, como testes de triagem ou confirmatórios, com variações na sensibilidade e especificidade. Para escolha do teste a ser usado, a disponibilidade de imunorreagentes comerciais, o treinamento da equipe, o antígeno utilizado, e o custo das técnicas devem ser considerados. Esta revisão apresenta os métodos sorológicos disponíveis para uso em diferentes fases dos programas de controle e erradicação da CAE e as medidas de manejo que devem ser adotadas em conjunto com o diagnóstico sorológico da enfermidade.Caprine arthritis encephalitis (CAE) is a chronic disease caused by a small ruminant lentivirus (SRLV), which causes significant losses in goat breeding. The actual state of animal infection with SRLV is difficult to determine due to a complex pathogenesis of the virus, including factors such as delayed or intermittent seroconversion in serological tests. Several serological techniques are available for disease diagnosis, such as screening or confirmation tests, which are different in sensitivity and specificity. Regarding the choice of the test to be applied, availability of commercial immunoreagents, team training, antigen used, and cost of techniques must be considered. This review presents the serological methods available for use in different stages of CAE control and eradication programs, and management measures to be adopted in conjunction with serological diagnosis of the disease

Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina

AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE DESCONTAMINAÇÃO PARA OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS DE LEPTOSPIRAS A PARTIR DE AMOSTRAS MISTAS COM Spirillum spp.

It is challenging to obtain pure cultures of Leptospira from environmental samples, mainly due to the presence of accompanying microbiota that can contaminate cultures, highlighting bacteria of the genus Spirillum that have characteristics similar to leptospires. Thus, cannot be eliminated by the most common decontamination techniques during leptospires isolation process. The purpose of this study was to evaluate five decontamination methods to obtain pure cultures of Leptospira from mixed samples with Spirillum spp. We collected ten samples from untreated domestic sewage dumped of to streets in Macapá city – Brazilian Amazon, and submitted to bacteriological culture for Leptospira isolation. The presence of leptospires was confirmed by visualization under dark-field microscopy and by 16S PCR. In the samples in which Spirillum was observed, five methods of decontamination were tested: 1 – Membrane filtration (0.20 μm and 0.22 μm); 2- Culture in selective medium for Leptospira spp.; 3- Centrifugation; 4- Serial dilution and 5- Plating on solid EMJH medium. Out of all 10 samples, five were positive for leptospires and in three there was the simultaneous detection of leptospires and Spirillum. Plating on solid EMJH medium (5) was the most efficient method, decontaminating all three mixed cultures. Only one culture was decontaminated by the technique of culture in selective medium for Leptospira spp. (2), and the other methods were ineffective. In conclusion, plating on solid EMJH medium method can be used to obtain pure cultures of Leptospira spp. from environmental samples containing Spirillum spp.Keywords: Leptospira; decontamination; mixed cultures; Spirillum.É um desafio obter culturas puras de Leptospira a partir de amostras ambientais, principalmente devido à presença de microbiota acompanhante que pode contaminar culturas, destacando bactérias do gênero Spirillum que possuem características semelhantes às leptospiras. Assim, não pode ser eliminado pelas técnicas mais comuns de descontaminação durante o processo de isolamento das leptospiras. O objetivo deste estudo foi avaliar cinco métodos de descontaminação para obter culturas puras de Leptospira a partir de amostras mistas com Spirillum spp. Foram coletadas dez amostras de esgoto doméstico não tratado descartado nas ruas da cidade de Macapá - Amazônia Brasileira, e submetidas à cultura bacteriológica para isolamento de Leptospira. A presença de leptospiras foi confirmada por visualização em microscopia de campo escuro e por 16S PCR. Nas amostras em que Spirillum foi observado, foram testados cinco métodos de descontaminação: 1 - Filtragem por membrana (0,20 μm e 0,22 μm); 2- Cultura em meio seletivo para Leptospira spp.; 3- Centrifugação; 4- Diluição em série e 5- Plaqueamento em meio sólido EMJH. Das 10 amostras, cinco foram positivas para leptospiras e em três houve a detecção simultânea de leptospiras e Spirillum. Plaqueamento em meio sólido EMJH (5) foi o método mais eficiente, descontaminando as três culturas mistas. Apenas uma cultura foi descontaminada pela técnica de cultura em meio seletivo para Leptospira spp. (2), e os outros métodos foram ineficazes. Em conclusão, o método de plaqueamento em meio sólido EMJH pode ser usado para obter culturas puras de Leptospira spp. de amostras ambientais contendo Spirillum spp.Palavras-chave: Leptospira, descontaminação, culturas mistas, Spirillum

High sero-prevalence of caseous lymphadenitis identified in slaughterhouse samples as a consequence of deficiencies in sheep farm management in the state of Minas Gerais, Brazil

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Caseous lymphadenitis (CLA), caused by <it>Corynebacterium pseudotuberculosis</it>, is one of the most important diseases of sheep and goats, causing considerable economic losses for herd owners.</p> <p>Results</p> <p>We assessed the seroprevalence of infection with <it>C. pseudotuberculosis </it>in 805 sheep from 23 sheep farms that supply slaughterhouses in the state of Minas Gerais; we also analyzed management practices that could be associated with CLA occurrence, used on these and nearby farms that also supplied animals to the slaughterhouse (n = 60). The serum samples for assaying CLA infection were taken at the slaughterhouse. Frequency of infection with <it>C. pseudotuberculosis </it>was estimated at 43.7%, and farm frequency was estimated at 100%. Management practices were analyzed through a questionnaire. All farmers (60/60) had extensive/semi-extensive rearing system; 70.0% (42/60) identified sheep individually; 11.7% (7/60) had periodical technical assistance; 41.7% (25/60) disinfected the facilities; 86.7% (52/60) used barbed wire fences and did not implement adequate CLA control measures; only 11.7% (7/60) of breeders reported vaccination against <it>C. pseudotuberculosis</it>; 13.3% (8/60) took note of animals with clinical signs of CLA; 1.7% (1/60) opened and sanitized abscesses, and isolated the infected animals; 10.0% (6/60) knew the zoonotic potential of this disease and 1.7% (1/60) of the farmers culled animals in case of recurrence of abscesses.</p> <p>Conclusions</p> <p>It can be concluded that <it>C. pseudotuberculosis </it>infection is widely spread in sheep flocks in Minas Gerais state in Brazil and that there is a lack of good management measures and vaccination, allowing transmission of this infectious agent throughout the production network.</p

Soroprevalência de anticorpos anti-rotavírus do sorogrupo A em bovinos de uma fronteira pioneira na Amazônia brasileira

Rotavirus is a worldwide etiologic agent of diarrhea, responsible for large economic losses. We studied the seroprevalence of antibodies to group A rotavirus in cattle in 67 smallholder farms from Uruará municipality, using counterimmunoelectroosmophoresis with the NCDV strain as a standard antigen. Prevalence of positive smallholder farms was 95.6-100%. Significant differences were seen between age groups when the seropositivity rose from the youngest to the oldest groups and between females and males older than 1 year, when the seropositivity was higher in the first group.O rotavírus é um agente etiológico de diarréias de distribuição mundial, responsável por grandes prejuízos econômicos. Pesquisou-se a soroprevalência de anticorpos anti-rotavírus do sorogrupo A em bovinos criados no município de Uruará, utilizando a técnica da contraimunoeletroosmofore com a amostra NCDV como antígeno padrão. A prevalência de propriedades positivas foi de 95.6-100%. Diferenças significativas foram observadas entre as sucessivas faixas etárias, quando a soropositividade aumentou dos grupos mais jovens para os mais velhos, bem como entre fêmeas e machos maiores de 1 ano, quando a soropositividade foi maior no primeiro grupo

Survival and growth of ‘ciprés de la cordillera’ seedlings over seven years at two contrasting sites in northwestern Patagonia

Las especies forestales nativas permiten restaurar bosques y son una alternativa productiva sustentable. Como en cualquier forestación, en bosques implantados o enriquecidos con nativas, el conocimiento sobre la dinámica de los plantines resulta clave para establecer estrategias de manejo. En este estudio describimos la dinámica de la supervivencia y el crecimiento en altura en plantines de ciprés de la cordillera (especie nativa de los bosques Andino-patagónicos de alto valor forestal) en matorrales de la Patagonia norte. Establecimos un experimento de plantación (275 plantines) en dos sitios contrastantes (un fondo de valle y una ladera de exposición norte) y durante 6 ó 7 años, dependiendo del sitio, en cada primavera registramos la supervivencia y la altura de los plantines. Evaluamos además el efecto de la protección contra herbívoros y modelamos la dinámica del ramoneo. La supervivencia y el ramoneo la evaluamos con modelos lineales generalizados, y para la altura ajustamos un modelo no lineal de efectos mixtos que permitió cuantificar la tasa de crecimiento de cada plantín. En el fondo de valle, la supervivencia disminuyó hasta menos del 15% al finalizar el experimento. En la ladera de exposición norte, la supervivencia fue más alta y se mantuvo relativamente estable. En este sitio, los valores de supervivencia (~70% al séptimo año) y crecimiento en altura (tasas mayores al 15%; IMA ~8 cm/año) fueron comparables a los reportados en plantaciones bajo bosque de ciprés de la cordillera, lo que sugiere que la especie se podría utilizar para restaurar/producir en matorrales mixtos de exposición norte. Los protectores redujeron el ramoneo, aumentaron la supervivencia, aunque no significativamente, y atenuaron el crecimiento. Por lo tanto, no es clara la conveniencia de proteger los plantines con el tipo de protector evaluado. Esperamos que nuestros resultados contribuyan con la gestión sustentable de los matorrales y bosques de la Patagonia norte.Native forestry species enable forest restoration and are a sustainable productive alternative. In any forest plantation, among them those in which native tree species are used, knowledge on seedling dynamics is a highly relevant for planning and management. We describe the seedling dynamics —survival and height growth— of planted ‘ciprés de la cordillera’, a high-value timber species of the Andean-Patagonian forests, in northern Patagonia shrublands. We carried out a 7-years planting experiment (275 seedlings) in two contrasting sites (a valley bottom and a northern-exposure hillside), and each spring we recorded the survival and height of the seedlings. In addition, we evaluated the effect of protecting the seedlings from herbivores and modeled the browsing dynamics. Survival and browsing were evaluated with generalized linear models while height was modeled with a non-linear mixed-effects model from which we quantified the growth rate per seedling. At the valley bottom, survival decreased to <15% at the end of the experiment. Survival was higher in the hillside with north exposure and remained relatively stable. At this site, the values of survival (~70% at year 7) and height growth (rates greater than 15%; MAI ~8 cm/year) were comparable with those of seedlings planted in forests of ‘ciprés de la cordillera’, suggesting that the species could be used for restoration or production in northern hillsides like the one assayed. Seedling protectors reduced browsing, increased survival although not significantly, and diminished growth. Therefore, it is not clear whether seedlings should be protected using the protector type tested in this study. We hope our results contribute to the sustainable management of shrublands and forests of northern Patagonia.Fil: Oddi, Facundo José. Universidad Nacional de Río Negro. Sede Andina. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural. - Universidad Nacional de Rio Negro. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; ArgentinaFil: Goldenberg, Matías Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural. - Universidad Nacional de Rio Negro. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; Argentina. Universidad Nacional de Río Negro. Sede Andina. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; ArgentinaFil: Nacif, Marcos Ezequiel. Universidad Nacional de Río Negro. Sede Andina. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural. - Universidad Nacional de Rio Negro. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; ArgentinaFil: Heinemann, Karin. Sociedad Naturalista Andino Patagonica; ArgentinaFil: Garibaldi, Lucas Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural. - Universidad Nacional de Rio Negro. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; Argentina. Universidad Nacional de Río Negro. Sede Andina. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales, Agroecología y Desarrollo Rural; Argentin