The Notch Delta-4 ligand helps to maintain the quiescence and the short-term reconstitutive potential of Haematopoietic Progenitor Cells through activation of a key gene network: Delta-4/Notch pathway retains the HPCs potential

International audienceUnderstanding the role of Notch and its ligands within the different bone marrow niches could shed light on the mechanisms regulating haematopoietic progenitor cells (HPCs) maintenance and self renewal. Here, we report that murine bone marrow HPCs activation by the vascular Notch Delta4 ligand maintains a significant proportion of cells specifically in the G0 state. Furthermore, Delta4/Notch pathway limits significantly the loss of the in vivo short-term reconstitutive potential upon transplantation of Delta-4 activated HPCs into lethally irradiated recipient mice. Both effects are directly correlated with the decrease of cell cycle genes transcription such as CYCLIN-D1, − D2, and -D3, and the upregulation of stemness related genes transcription such as BMI1, GATA2, HOXB4 and C-MYC. In addition, the transcriptional screening also highlights new downstream post-transcriptional factors, named PUMILIO1 and − 2, as part of the stem signature associated with the Delta4/Notch signalling pathway

Etude des mécanismes moléculaires des protéines de liaison à l’ARNm PUMILIO 1 et 2 dans la régulation des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques normales et pathologiques

Les protéines de liaison à l’ARN PUMILIO 1 et 2 (PUM1/2) exercent un rôle central dans le maintien des cellules souches chez les Invertébrés en se fixant, en association avec des partenaires protéiques, sur la région 3’ UTR de certains ARNm, régulant ainsi leur devenir. A ce jour, le rôle de PUM1/2 dans les cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (CSPHs) a été peu étudié. La perte de la coordination entre auto-renouvellement et différenciation des CSPHs peut aboutir à des hémopathies chez l'Homme, d’où la nécessité de comprendre les mécanismes sous-jacents. Notre équipe a mis en évidence, par une approche de shARN, que l’invalidation des protéines PUM1/2 dans les CSHs humaines et murines conduit à une réduction de leur expansion, associée à une apoptose accrue et un arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1, et aussi à une perte du potentiel clonogénique in vitro et du potentiel de reconstitution in vivo. L’objectif de notre travail a consisté à : a/ évaluer les effets de la surexpression de PUM1/2 dans les CSPHs, b/ déterminer l’implication de PUM1/2 dans les processus leucémiques, c/ étudier les mécanismes moléculaires responsables de l’activité de PUM1/2 en identifiant les cibles et les partenaires protéiques par une approche de protéomique globale. Nos résultats suggèrent qu’une surexpression modérée de PUM1 (2/3 fois) dans les cellules CD34+ limite la perte du potentiel clonogénique alors qu’une expression plus élevée (5/10 fois et plus) est toxique. L’analyse de l’expression de PUM1/2 par RT-qPCR dans les échantillons de Leucémies Aigue Myeloïdes (LAM) (GOELAMSthèque) montre une augmentation significative dans les échantillons les plus immatures (LAM0-2) comparés aux contrôles sains. La perte de PUM1/2 par shARN dans les cellules primaires de leucémies ainsi que dans des lignées issues de différents processus leucémiques réduit fortement leur survie. La recherche des partenaires associés à PUM par spectrométrie de masse a permis de découvrir Argonaute2 et MOV10 (tous les 2 impliqués dans la machinerie des miRNA), ainsi que des protéines de liaison aux ARNs, ELAV1 déjà connue pour son implication dans le maintien des CSH murines et IMP3, impliqué dans de nombreux cancers et dans la régulation du cycle cellulaire. L’invalidation de IMP3 ou ELAV1 dans les CSPHs conduisent, in vitro, aux mêmes effets observés avec la perte du PUM 1/2, une diminution de l’expansion avec une augmentation de l’apoptose, et la perte du potentiel clonogénique. Enfin, nous avons identifié FoxP1 (Forkhead box P1) comme nouvelle cible directe de PUM1/2, dont le rôle est encore très peu décrit dans l’hématopoïèse. L’étude fonctionnelle de FoxP1 sur les CSPHs par shARN mime les effets observés avec les facteurs PUM1/2. De plus, la surexpression de FoxP1 restaure partiellement les activités antiprolifératives et pro-apoptotiques générées par les shPUM1/2. Enfin, le profil d’expression de FoxP1 dans les LAM corrèle avec le profil d’expression de PUM1/2. Nos résultats confirment le rôle majeur joué par les protéines PUM1/2 en partie via la régulation positive de FoxP1 qui contribue au maintien les CSPHs normales et pathologiques.Pumilio 1 and 2 (PUM1/2) RNA-binding proteins exert a central role in stem cell maintenance among Invertebrates by binding the 3'UTR of mRNA targets in association with protein partners, thus regulating mRNA stability/translation. Nothing is known regarding normal and pathologic hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Loss of coordination between self-renewal and differentiation of HSPCs can lead to leukemia in humans, hence the need to understand the mechanisms. Our team has highlighted the fundamental role played by the post-transcriptional regulators Pumilio (PUM) 1/2 on normal HSPC properties. By a shRNA approach, PUM 1/2 knockdown in human and murine HSPCs leads to: a/ a reduced expansion associated with an increased apoptosis and a cell cycle arrest in G0/G1 phase, b/ the loss of their clonogenic capacity and their in vivo reconstitution potential. The objective of our work is to: a/ evaluate the effects of PUM 1/2 overexpression in HSPC, b/ determine PUM1/2 involvement in leukemic processes; c/ investigate the molecular mechanisms responsible of PUM activity in HSPC by identifying protein targets and partners. Our results showed that a moderate overexpression of PUM1 (2 to 3 fold) in normal CD34+ HSPCs limits the loss of their clonogenic potential, while a higher expression (5 to 10 fold or more) is toxic. The expression analysis of PUM1/2 transcripts in Acute Myeloid Leukemia (AML) (GOELAMSthèque) showed a significant increase in the most immature samples (AML0-2) as compared to healthy controls. PUM1/2 knockdown by shRNA in AML cells significantly reduced their survival. The same effect was observed in cell lines from several leukemic processes. We identified various PUM-associated partners by mass spectrometry, Argonaute2 and MOV10 (involved in the miRNA machinery), and the RNA-binding proteins IMP3 (involved in several cancer and in cell cycle regulation) and HuR/ELAV1 (already known to be involved in murine HSPCs maintenance). IMP3 or ELAV1 knockdown in HSPCs in vitro lead to the same effect of a PUM1/2 invalidation, a decreased expansion with an increased apoptosis and the loss of clonogenic potential. Finally, we identify the forkhead box P1 (FOXP1) transcription factor as a new direct target up-regulated by PUM1 and PUM2. Functional study of FoxP1 knockdown by shRNA in HSPCs mimic PUM1/2 activities. Moreover, FOXP1 overexpression partially rescued shPUM antiproliferative and pro-apoptotic effects. Also, the PUM1/2 and FOXP1 expression levels in leukemic primary cells were measured by RT-qPCR and revealed a positive correlation. Our results reveal that PUM1/2 are direct positive regulators of FOXP1 which contributes to the maintenance of normal and leukemic HSPCs

PUMILIO/FOXP1 signaling drives expansion of hematopoietic stem/progenitor and leukemia cells

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