Effects of Salinomycin and Everolimus on Breast Cancer Stem Cells in Hypoxia

Cancer stem cells (CSCs) are a collection of small numbers of cells that have the potential to induce all cell types within the tumor mass and have self-renewal capacity. Today, the reasons for the failure of conventional cancer therapies lie in the fact that they are unable to target cancer stem cells. Targeting the cancer stem cell is thought to provide a very important and revolutionary advance in cancer cell targeting and therapy Tumor hypoxia is a characteristic of solid tumors and has been associated with poor prognosis and resistance to radiotherapy and chemotherapy. HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1) is the major transcription factor activated in hypoxic conditions and allows transcriptional activation of various genes that are effective for the adaptation of the cell to the hypoxic condition. Experimental studies have provided evidence that also hypoxia and HIF-1alpha%253B promote the cancer stem cell phenotype and targeting of HIF-1alpha%253B may reduce or eliminate cancer stem cells. Breast cancer is the most common form of cancer in women worldwide and affects 10%25 of the world%252339%253Bs female population. 25%25 to 30%25 of patients with invasive breast cancer still die from this disease. The recurrence frequency of the disease varies between 60%25 and 80%25 within the first 3 years after treatment. In order to target breast cancer stem cells more effectively, in this study we aimed to reveal whether the hypoxic conditions in the tumor, which act as the stem cell production area, at the same time creates resistance to therapy. Thus, we evaluated effect of CSCs targeting agent Salinomycin alone or in combination with Everolimus which is an m-TOR and HIF-1alpha%253B inhibitor on parental MCF-7 and MDA-231 breast cancer cells and their isolated CSCs in hypoxic conditions. Here it is presented that starting with 2 mM, increased concentrations of salinomycin significantly inhibits proliferation and induce apoptosis in hypoxia, in both parental MCF-7 and MDA-231 breast cancer cells and in their isolated CSCs. The most effective concentration of salinomycin was 10 mM and induced around 35%25 and 45%25 of apoptosis in both parental MCF-7 and MDA-231 and their isolated CSCs, respectively. Whereas everolimus alone was not as effective as salinomycin, as 25 mM everolimus induced 30%25 and 15%25 of growth inhibition or apoptosis in both parental and CSCs of MCF-7 and MDA-231 cellsin hypoxia, respectively. When lower concentrations of salinomycin (2mM) and everolimus (5mM) was used in combination they show synergistic effect and able to inhibit proliferation at least 35%25 and 45%25 in both parental and CSCs of MCF-7 and MDA-231 cells in hypoxia, respectively. Similar results were also obtained for induction of apoptosis in response to salinomycin %2B everolimus treatment in hypoxia in both parental and CSCs of MCF-7 and MDA-231 cells. Hence using lower concentrations of salinomycin and everolimus together may provide an effective targeting strategy for hypoxic CSCs and may contribute to the development of novel strategies for therapeutic intervention in breast cancer

Therapy Induced Senescence Promote Expression of Death Receptors in Breast Cancer Cells

Chemotherapeutic agents that cause DNA damage also induce cellular senescence known as therapy-induced senescence (TIS). Cells undergoing senescence may exert detrimental effects by promoting tumor progression in healthy cells or supporting metastases in cancer cells due to senesence-associated secretory phenotype (SASP), involving secretion of chemokines, cytokines, metalloproteinases, and growth factors. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor superfamily and implicated in induction of apoptosis via activation of extrinsic pathway. The most recognized death receptors are FAS (CD95), TNFR1 and TRAIL-R1 %252F 2 (DR4-DR5) etc. and capable of directly inducing apoptosis in the cell. In this study we aim to investigate the expression of cell death receptors in response to TIS of breast cancer cells for their potential use in elimination of senescent cells. Doxorubicin and etoposide were used to induce senescence selectively in MCF7 breast cancer cell line. Senescence induction was confirmed by beta%253B-galactosidase staining and cell cycle analysis. Activations of p53, p21, and gamma%253B-H2AX and expression levels of cell death receptors (FAS (CD95), TNFR1-2 and DR5 were tested by western blot analysis. Apoptosis was measured by Annexin V%252F7AAD analysis. Here, we show that chemotherapy agents etoposide and doxorubicin induced senescence by arresting MCF-12A and MCF-7 cells in G1 and G2%252FM phases of cell cycle., respectively. In addition, Induction of senescence is confirmed by SA-beta%253B-gal staining and by activation of g-H2AX, p53 and p21 proteins. Neither etoposide nor doxorubicin induced significant apoptosis in MCF12A or MCF-7 cells. Importantly, TIS increased the protein levels of TNFR1, TNFR2 and DR5 receptors selectively in MCF-7 cells but not in MCF-12A cells. These data suggest that chemotherapy agents induce senescence increased the expression of death receptors in breast cancer cell line MCF-7 thus provide a basis for further investigation of death receptor mediated targeting of senescent cells as potential therapeutic strategy

Hipoksinin meme kanseri hücre dizisinde Wip1 fosfataz ve ‘DNA hasarı cevabının’ regülasyonu üzerine etkilerinin araştırılması

Solid tümörlerin karakteristiği olarak bilinen tümör hipoksisi radyoterapi ve kemoterapiye direnç oluşturmakta ve tipik olarak kötü prognozla da ilişkili olarak görülmektedir. PPM1D/Wip1 fosfataz (Protein phosphatase 1D magnesium dependent/wild type p53 induced phosphatase) özellikle genotoksik stresle p53’e bağlı olarak indüklenir ve DNA hasarı sonrası, p53’ün ATM/ATR kinazlarca başlatılan aktivasyonunu kapatmada önemli rol oynayarak DNA hasarı cevabını (DDR) sonlandırır. Wip1 aşırı ifade edildiğinde onkogen özelliği kazanmakta ve DDR ile p53’e bağlı tümör süpresör cevapları (apoptozis ve senesens) inhibe edebilmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda hipoksi koşullarının Wip1 fosfatazı aşırı ifade eden tümörlerde DDR’nin regülasyonunu ve kemoterapiye cevabı nasıl etkilediği konusunda hemen hemen hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle Wip1 fosfatazı aşırı ekspresse ettiği bilinen meme kanseri hücre dizisi MCF-7’de hipoksi koşullarında Wip1’in inhibitörü GSK2830371 (GSK) ile baskılanmasının DNA hasarı cevabının regülasyonunda ve kemoterapötik ajan Doksorubisin’le birlikte apoptozis ve senesens üzerine etkileri araştırılmıştır. MCF-7 hücrelerinde GSK+Doksorubisin uygulamasının hem normoksik hem de hipoksik koşulda sinerjistik etki göstererek apoptozis ve senesensi DDR’ın önemli elemanlarından γH2AX fosforilasyonunu takiben Chk2-p53-p21 aktivasyonuyla artırdığı ve hücre döngüsünün S fazında belirgin bir artış sağladığı tespit edilmiştir. Bu veriler GSK’nın Wip1’i aşırı ifade eden hipoksik tümörlerde de oldukça iyi bir kombinasyon ajanı olabileceğine işaret etmektedir.Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TPF-18007 proje numarası ile desteklenmiştir.KABUL VE ONAY SAYFASI i TEŞEKKÜR ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ ix TABLOLAR DİZİNİ xii ÖZET xiii ABSTRACT xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Normoksi ve Hipoksi 4 2.1.1. Hipoksi ve HIFler 4 2.1.2. HIF1-α’nın Transkripsiyonunu Sağladığı Hedef Genler 7 2.1.3. Hipoksi ve DNA Hasarı Cevabı 9 2.2.2. DNA Hasarı Cevabı 10 2.3. Wip1 Fosfataz 12 2.3.1. Wip1 Fosfatazın DNA Hasarı Cevabındaki Rolü 13 2.4. Çalışmanın Yapılmasının Amacı 19 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 21 3.1. Çalışmada Kullanılan Hücre Dizisi 21 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Besiyeri ve Kimyasallar 21 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Antikorlar 22 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Malzemeler 22 3.1.4. Kullanılan Kitler ve Problar 23 3.1.5. Kullanılan Cihazlar ve Aletler 23 3.2. Yöntem 24 3.2.1. Hücre Kültürü Çalışmaları 24 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması 24 3.2.3. Hücrelerin Dondurulup Saklanma İşlemi Dondurma Besiyeri İçeriği 25 3.2.4. Hücrelerin Çözdürülüp Kullanılması 25 3.2.5. Hücrelerin Sayım Yöntemi 25 3.2.6. İlaç Stoklarının Hazırlanması 26 3.2.7. Hücrelerin İnkübasyon Koşullarının Hazırlanması 26 3.2.8. Hücre Kültürü Çalışmalarının ve Sonrasında Yapılacak Olan Analizlerin Hazırlanışı 27 3.2.8.1. MCF-7 hücre hattında apoptozisin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 27 3.2.8.2. MCF-7 hücre hattında senesensin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 28 3.2.8.3. Wst-1 testi 28 3.2.8.4. SA-β-Galaktozidaz boyama testi 29 3.2.8.5. Annexin V apoptozis testi 30 3.2.8.6. Hücre döngüsü testi 30 3.2.8.7. H2A.X testi 31 3.2.8.8. Western Blot analizi için yapılan çalışmalar 32 3.2.8.8.1. Protein izolasyonu 32 3.2.8.8.2. Protein miktar tayini 32 3.2.8.8.3. Western Blot analizi 33 3.2.8.8.3.1. Poliakrilamid jelin (SDS-PAGE) hazırlanması 33 3.2.8.8.3.2. Jele yüklenecek protein örneklerinin hazırlanması 34 3.2.8.8.3.3. Elektroforetik yürütme işlemi 34 3.2.8.8.3.4. Yarı-kuru transfer (semi-dry blotting) 35 3.2.8.8.3.5. Membranı bloklama işlemi 35 3.2.8.8.3.6. Membranın primer antikor ile muamelesi 35 3.2.8.8.3.7. Membranın sekonder antikor ile muamelesi 36 3.2.8.8.3.8. Kemilüminesans yöntem ile membranı görüntüleme 36 3.2.8.9. DNA izolasyonu 37 3.2.8.10. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 37 3.2.8.10.1. PCR örneklerinin agaroz jel elektroforezinde yürütülmesi 39 3.2.8.10.2. PCR örneklerinin Sanger sekanslama yöntemiyle sekanslanması 40 3.2.8.11. Real Time PCR analizi (q-PCR) 40 3.2.8.11.1. Taqman gen kopya sayısı analizi 40 3.2.8.12. Total RNA izolasyonu 42 3.2.8.12.1. İzole edilen RNAlara DNaz muamelesi 42 3.2.8.13. Gen ekspresyon analizi 43 3.2.8.13.1. Komplementer DNA(cDNA)sentezi 43 3.2.8.13.2. Gen ekspresyon seviyesinin q-PCR ile belirlenmesi 43 3.2.8.14. Floresan in-situ hibridizasyon(FISH) analizi 44 3.2.8.14.1. MCF-7 hücresinin parafine gömülmesi 44 3.2.8.14.2. MCF-7 hücresinin hematoksilen-eozinle boyanması 45 3.2.8.14.3. MCF-7 hücresinin FISH analizi 45 3.2.9. Grafiklerin Hazırlanışı ve İstatistiksel Analizlerin Belirlenmesi 47 4. BULGULAR 48 4.1. MCF-7 Hücrelerinde PPM1D/Wip1’in Gen Kopya Sayısı Analizi Düzeyi 48 4.2. MCF-7 Hücrelerinde Wip1’in FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon) Yöntemiyle Gösterilmesi 48 4.3. MCF-7 PCR ve Sekans Sonuçları 50 4.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 mRNA Düzeyi 55 4.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde HIF1-α mRNA düzeyi 57 4.6. MCF-7 Hücrelerinin Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 57 4.7. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücreleri Üzerinde Etkileri 58 4.7.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Hücre Canlılığı Üzerine Etkileri 59 4.7.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Apoptotik etkileri 61 4.7.3. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının Hücre Döngüsü Üzerine Etkileri 69 4.8. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 Saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Senesens İndükleyici Etkileri 74 4.8.1. SA-β-Galaktosidaz Boyaması 74 4.8.2. H2A.X Analizi 76 4.8.3. Hücre Döngüsü Analizi 80 4.8.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 85 4.8.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 92 5. TARTIŞMA 98 5.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 Düzeyi 101 5.2. MCF-7 Hücrelerinde Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 102 5.2.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücre Döngüsü Üzerinde Etkileri 104 5.2.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Apoptotik etkileri 106 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 113 KAYNAKLAR 115 ÖZGEÇMİŞ 12

Hipoksinin meme kanseri hücre dizisinde Wip1 fosfataz ve ‘DNA hasarı cevabının’ regülasyonu üzerine etkilerinin araştırılması

Solid tümörlerin karakteristiği olarak bilinen tümör hipoksisi radyoterapi ve kemoterapiye direnç oluşturmakta ve tipik olarak kötü prognozla da ilişkili olarak görülmektedir. PPM1D/Wip1 fosfataz (Protein phosphatase 1D magnesium dependent/wild type p53 induced phosphatase) özellikle genotoksik stresle p53’e bağlı olarak indüklenir ve DNA hasarı sonrası, p53’ün ATM/ATR kinazlarca başlatılan aktivasyonunu kapatmada önemli rol oynayarak DNA hasarı cevabını (DDR) sonlandırır. Wip1 aşırı ifade edildiğinde onkogen özelliği kazanmakta ve DDR ile p53’e bağlı tümör süpresör cevapları (apoptozis ve senesens) inhibe edebilmektedir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda hipoksi koşullarının Wip1 fosfatazı aşırı ifade eden tümörlerde DDR’nin regülasyonunu ve kemoterapiye cevabı nasıl etkilediği konusunda hemen hemen hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle Wip1 fosfatazı aşırı ekspresse ettiği bilinen meme kanseri hücre dizisi MCF-7’de hipoksi koşullarında Wip1’in inhibitörü GSK2830371 (GSK) ile baskılanmasının DNA hasarı cevabının regülasyonunda ve kemoterapötik ajan Doksorubisin’le birlikte apoptozis ve senesens üzerine etkileri araştırılmıştır. MCF-7 hücrelerinde GSK+Doksorubisin uygulamasının hem normoksik hem de hipoksik koşulda sinerjistik etki göstererek apoptozis ve senesensi DDR’ın önemli elemanlarından γH2AX fosforilasyonunu takiben Chk2-p53-p21 aktivasyonuyla artırdığı ve hücre döngüsünün S fazında belirgin bir artış sağladığı tespit edilmiştir. Bu veriler GSK’nın Wip1’i aşırı ifade eden hipoksik tümörlerde de oldukça iyi bir kombinasyon ajanı olabileceğine işaret etmektedir.Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TPF-18007 proje numarası ile desteklenmiştir.KABUL VE ONAY SAYFASI i TEŞEKKÜR ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ ix TABLOLAR DİZİNİ xii ÖZET xiii ABSTRACT xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Normoksi ve Hipoksi 4 2.1.1. Hipoksi ve HIFler 4 2.1.2. HIF1-α’nın Transkripsiyonunu Sağladığı Hedef Genler 7 2.1.3. Hipoksi ve DNA Hasarı Cevabı 9 2.2.2. DNA Hasarı Cevabı 10 2.3. Wip1 Fosfataz 12 2.3.1. Wip1 Fosfatazın DNA Hasarı Cevabındaki Rolü 13 2.4. Çalışmanın Yapılmasının Amacı 19 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 21 3.1. Çalışmada Kullanılan Hücre Dizisi 21 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Besiyeri ve Kimyasallar 21 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Antikorlar 22 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Malzemeler 22 3.1.4. Kullanılan Kitler ve Problar 23 3.1.5. Kullanılan Cihazlar ve Aletler 23 3.2. Yöntem 24 3.2.1. Hücre Kültürü Çalışmaları 24 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması 24 3.2.3. Hücrelerin Dondurulup Saklanma İşlemi Dondurma Besiyeri İçeriği 25 3.2.4. Hücrelerin Çözdürülüp Kullanılması 25 3.2.5. Hücrelerin Sayım Yöntemi 25 3.2.6. İlaç Stoklarının Hazırlanması 26 3.2.7. Hücrelerin İnkübasyon Koşullarının Hazırlanması 26 3.2.8. Hücre Kültürü Çalışmalarının ve Sonrasında Yapılacak Olan Analizlerin Hazırlanışı 27 3.2.8.1. MCF-7 hücre hattında apoptozisin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 27 3.2.8.2. MCF-7 hücre hattında senesensin indüklendiği çalışmaların hazırlanışı 28 3.2.8.3. Wst-1 testi 28 3.2.8.4. SA-β-Galaktozidaz boyama testi 29 3.2.8.5. Annexin V apoptozis testi 30 3.2.8.6. Hücre döngüsü testi 30 3.2.8.7. H2A.X testi 31 3.2.8.8. Western Blot analizi için yapılan çalışmalar 32 3.2.8.8.1. Protein izolasyonu 32 3.2.8.8.2. Protein miktar tayini 32 3.2.8.8.3. Western Blot analizi 33 3.2.8.8.3.1. Poliakrilamid jelin (SDS-PAGE) hazırlanması 33 3.2.8.8.3.2. Jele yüklenecek protein örneklerinin hazırlanması 34 3.2.8.8.3.3. Elektroforetik yürütme işlemi 34 3.2.8.8.3.4. Yarı-kuru transfer (semi-dry blotting) 35 3.2.8.8.3.5. Membranı bloklama işlemi 35 3.2.8.8.3.6. Membranın primer antikor ile muamelesi 35 3.2.8.8.3.7. Membranın sekonder antikor ile muamelesi 36 3.2.8.8.3.8. Kemilüminesans yöntem ile membranı görüntüleme 36 3.2.8.9. DNA izolasyonu 37 3.2.8.10. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 37 3.2.8.10.1. PCR örneklerinin agaroz jel elektroforezinde yürütülmesi 39 3.2.8.10.2. PCR örneklerinin Sanger sekanslama yöntemiyle sekanslanması 40 3.2.8.11. Real Time PCR analizi (q-PCR) 40 3.2.8.11.1. Taqman gen kopya sayısı analizi 40 3.2.8.12. Total RNA izolasyonu 42 3.2.8.12.1. İzole edilen RNAlara DNaz muamelesi 42 3.2.8.13. Gen ekspresyon analizi 43 3.2.8.13.1. Komplementer DNA(cDNA)sentezi 43 3.2.8.13.2. Gen ekspresyon seviyesinin q-PCR ile belirlenmesi 43 3.2.8.14. Floresan in-situ hibridizasyon(FISH) analizi 44 3.2.8.14.1. MCF-7 hücresinin parafine gömülmesi 44 3.2.8.14.2. MCF-7 hücresinin hematoksilen-eozinle boyanması 45 3.2.8.14.3. MCF-7 hücresinin FISH analizi 45 3.2.9. Grafiklerin Hazırlanışı ve İstatistiksel Analizlerin Belirlenmesi 47 4. BULGULAR 48 4.1. MCF-7 Hücrelerinde PPM1D/Wip1’in Gen Kopya Sayısı Analizi Düzeyi 48 4.2. MCF-7 Hücrelerinde Wip1’in FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon) Yöntemiyle Gösterilmesi 48 4.3. MCF-7 PCR ve Sekans Sonuçları 50 4.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 mRNA Düzeyi 55 4.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde HIF1-α mRNA düzeyi 57 4.6. MCF-7 Hücrelerinin Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 57 4.7. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücreleri Üzerinde Etkileri 58 4.7.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Hücre Canlılığı Üzerine Etkileri 59 4.7.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 Saat GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının Apoptotik etkileri 61 4.7.3. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının Hücre Döngüsü Üzerine Etkileri 69 4.8. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 Saat GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Senesens İndükleyici Etkileri 74 4.8.1. SA-β-Galaktosidaz Boyaması 74 4.8.2. H2A.X Analizi 76 4.8.3. Hücre Döngüsü Analizi 80 4.8.4. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 24 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 85 4.8.5. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında 72 saat Doxorubicine veya GSK2830371 ve Doksorubisine Uygulanan MCF-7 Hücrelerinde DDR Analizi 92 5. TARTIŞMA 98 5.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında MCF-7 Hücrelerinde Wip1 Düzeyi 101 5.2. MCF-7 Hücrelerinde Normoksi ve Hipokside Wip1’in GSK2830371 Tarafından İnhibisyonu 102 5.2.1. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücre Döngüsü Üzerinde Etkileri 104 5.2.2. Normoksi ve Hipoksi Koşullarında GSK2830371 ve Doxorubicin Uygulamasının MCF-7 Hücrelerinde Apoptotik etkileri 106 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 113 KAYNAKLAR 115 ÖZGEÇMİŞ 12

Oncogenic WIP1 phosphatase attenuates the DNA damage response and sensitizes p53 mutant Jurkat cells to apoptosis

Wild-type (wt) p53-induced phosphatase 1 (Wip1), encoded by the protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent 1D (PPM1D) gene, is a serine/threonine phosphatase induced upon genotoxic stress in a p53-dependent manner. Wip1/PPM1D is frequently overexpressed, amplified and mutated in human solid tumors harboring wt p53 and is thus currently recognized as an oncogene. Oncogenic Wip1 dampens cellular stress responses, such as cell cycle checkpoints, apoptosis and senescence, and consequently increases resistance to anticancer therapeutics. Targeting Wip1 has emerged as a therapeutic strategy for tumors harboring wt p53. However, little is known about the efficacy of Wip1-targeted therapies in tumors lacking p53. The present study aimed to investigate the potential role of oncogenic Wip1 in p53 mutant (mt) Jurkat cells. In the present study, it was demonstrated that p53 mt Jurkat cells exhibited PPM1D/Wip1 gene amplification and expressed relatively high levels of Wip1, as confirmed by gene copy number and RNA expression analysis. In addition, Jurkat cells underwent G2 cell cycle arrest, apoptotic cell death and senescence in response to etoposide and doxorubicin, although the phosphorylation levels of DNA damage response (DDR) elements, including ataxia-telangiectasia mutated, ataxia-telangiestasia and Rad3-related, checkpoint kinase (Chk)1 and Chk2 were significantly low. Accordingly, the targeting of Wip1 phosphatase by RNA interference increased the phosphorylation of DDR elements, but decreased the rate of apoptosis in response to etoposide or doxorubicin in Jurkat cells. The induction of senescence or cell cycle arrest was not affected by the knockdown of Wip1. The results suggest that increased Wip1 expression enhances the apoptotic sensitivity of Jurkat cells in response to chemotherapeutic agents by attenuating DDR signaling. The present study highlights the possible pro-apoptotic role of Wip1 in a p53 mt T-cell acute lymphoblastic leukemia cell line. The data suggest the careful consideration of future treatment strategies aiming to manipulate or target Wip1 in human cancers lacking p53