Expression of a rice chitinase gene in transgenic banana ('Gros Michel', AAA genome group) confers resistance to black leaf streak disease

Peer reviewe

Optimisation of in vitro multiple meristem cultures and embryogenic cell suspensions in banana (Musa spp.)

Bananen en plantanen (Musa species) zijn eenzaadlobbige, meerjarig e grassen die voornamelijk geteeld worden in de ontwikkelingslanden van de tropen. Ze zijn vatbaar voor vele ziektes en plagen welke aanzienlijk e opbrengstverliezen veroorzaken. Klassieke veredeling van bananen en pl antanen is enorm moeilijk omwille van de hoge graad van steriliteit bij de belangrijkste variëteiten. Biotechnologie biedt veredelaars een belan grijk middel voor de productie van verbeterde variëteiten. Sterk regener eerbare en snel vermenigvuldigende scheutculturen ook meervoudige meri steemculturen genoemd zijn uiterst waardevol voor verschillende biotec hnologische toepassingen in banaan. Het aanmaken van meervoudige meriste emculturen (MMC) van hoogwaardige kwaliteit vormt bovendien de eerste cr uciale in vitro stap naar een succesvolle ontwikkeling van em bryogene celsuspensies (ECS) via de scalp methode . Embryogene celsuspe nsies van hoogwaardige kwaliteit zijn op hun beurt het meest geschikte u itgangsmateriaal voor genetische manipulatie. De belangrijkste doelstell ingen van het onderzoek dat uitgevoerd werd in het kader van deze doctor aatsthesis bestaan uit het verhogen van de efficiëntie van de weefselkwe eksystemen die leiden tot meervoudige meristeemculturen en embryogene ce lsuspensies in banaan. Om tegemoet te komen aan de nood tot een uitbreid ing van geschikt uitgangsmateriaal voor genetische manipulatie werden ve rbeterde protocols toegepast op een breed spectrum varieteiten behorende tot verschillende genomische (sub) groepen in Musa. In een eerste hoofdstuk wordt de oorsprong, klassificatie, verscheidenhe id, het belang en de morfologie van banaan beschreven, alsook de beperki ngen van klassieke veredeling van dit gewas. Naast een korte bespreking van enkele toepassingen van de biotechnologie in banaan, omvat dit hoofd stuk ook de nagestreefde doelstellingen en gevolgde strategieën tijdens dit werk. Toepassing van plantenbiotechnologie steunt op de ontwikkeling van weefs elkweeksystemen waarbij groeiende plantencellen, weefsels en organen afg ezonderd worden van de ouderplant en opgroeien op kunstmatige voedingsbo dems. De balans van toegediende plantengroeiregulatoren (PGR) vormt één van de sleutelfactoren bij het (her)oriënteren van de groei en ontw ikkeling van kunstmatig onderhouden weefsel. Deze toegediende PGR kunnen de functie, synthese, transport en/of actie van plantenhormonen (PH) ei gen aan het gekweekte weefsel nabootsen of ermee interfereren. Het tweed e hoofdstuk van deze thesis biedt een overzicht van de eigenschappen van de verschillende klassen PH en de voornaamste toepassingen van PGR in w eefselkweek. Naast de PGR balans worden groei en ontwikkeling ook beïnvl oed door andere componenten van de voedingsbodem en door omgevingsfactor en. Toch vormen het weefseltype zelf en zijn intrinsieke karakteristieke n de belangrijkste elementen die het succes of falen van weefselkweek be palen. De hoge graad van steriliteit die de meeste banaanvariëtieten ken merkt, heeft tot gevolg dat in vitro vermenigvuldiging b ij banaan beperkt is tot vegetatieve vermenigvuldiging. De verschillende methodes voor in vitro vegetatieve vermenigvuldiging bi j planten worden besproken in Hoofdstuk 3 en 4. Hoofdstuk 3 bevat een al gemeen overzicht wat betreft de oorsprong van meervoudige scheuten en he t proces van scheutvermeerdering. Hoofdstuk 4 behandelt de algemene aspe cten van vegetatieve vermeerdering via somatische embryogenese, alsook e en samenvatting van het eerder uitgevoerde onderzoek naar de ontwikkelin g van banaan ECS via de scalp methode. De Hoofdstukken 5 tot 9 beslaan het experimenteel gedeelte van deze stud ie. De belangrijkste doelstellingen van het onderzoek in Hoofdstukken 5 en 6 zijn (i) het werven van kennis betreffende de aard van banaan MMC e n (ii) de ontwikkeling van een efficiënte methode om MMC van hoogwaardig e kwaliteit te bekomen, dit op een snellere manier dan via de klassieke procedure. Onder hoogwaardige kwaliteit van MMC wordt verstaan dat deze zo homogeen mogelijk uit een maximale hoeveelheid meristematisch weefsel bestaan. Op basis van de universele beschikbaarheid van scheuten in in vi tro bewortelde planten van alle Musa variëteiten , werden deze scheuten geselecteerd als startmateriaal voor een nieuwe m ethode voor het aanmaken van MMC. Scheuten (met lengte van 0.1 cm) die e nkel de meristematische koepel en 1 omgevend bladprimordium omvatten, wa ren uniformer in vergelijking met scheuten met een lengte van 0.5 cm (wa arbij zich boven enkele millimeters cormusweefsel de meristematische koe pel bevindt die volledig bedekt is door 3 tot 4 bladprimordia). Zowel de scheuten met lengte van 0.1 cm als deze van 0.5 cm overleefden allemaal op een eerste vermenigvuldigingsmedium p5 (met 10 µM BAP). De in vitro procedure waarbij sterk regenereerbare en tr ansformeerbare meervoudige scheutculturen bekomen worden bij veel eenzaa dlobbigen en waarbij uitgegaan wordt van 0.5 cm scheuten werd succesvol toegepast op maïs. De ongewijzigde toepassing van dit protocol op banaan resulteerde in meervoudige scheutculturen met een stabiele vermeerderin gsfactor van amper 3 per maandelijkse cultuurcyclus. Wijzigingen qua gro otte van het uitgangsmateriaal of de BAP concentratie waren evenmin vold oende om snel vermenigvuldigende culturen te bekomen als eerder geobserv eerd bij maïs. Verschillende concentraties (van 1 tot 100 µM) van vijf verschillen de cytokinines (BAP, kinetin, 2iP, zeatin en TDZ) werden toegevoegd aan de voedingsbodems waarop kleine (0.1 cm lange) scheuten gekweekt werden. Volgende types van in vitro respons deden zich voor: afsterv en, uitgroei en vermenigvuldiging van uitgangsmateriaal. Drie maand na i noculatie varieerde de gemiddelde vermenigvuldigingssnelheid van het sta rtmateriaal van 1 tot 10 naargelang de concentratie en de aard van de to egediende bron aan cytokinines. Gemiddeld werden de meeste scheuten per initieel explant bekomen na behandeling met BAP en TDZ. De vermenigvuldi gingssnelheid in BAP culturen steeg geleidelijk met stijgende concentrat ies. TDZ daarentegen induceerde al vermenigvuldiging bij de laagst getes te concentratie (1 µM) maar was uiterst schadelijk bij 100 µM. Wanneer eerder geteste cytokinines toegevoegd werden in combinatie met h et auxine IAA werd een maximaal gemiddeld aantal scheuten per initieel e xplant (4 bij 3 maand oude culturen) bereikt na toevoegen van de hoogste BAP concentratie (50 µM) maar ook bij de laagste TDZ concentratie (1 µM). In combinatie met IAA, NAA of IBA veroorzaakten de cytokini nes dezelfde types van in vitro respons als in afwezighe id van een externe auxine bron. Bijkomende types van in vitro&amp;nb sp;respons werden geobserveerd wanneer de auxines Picloram of 2,4-D t oegevoegd werden. Scheuten groeiden uit of ontwikkelden tot meervoudige scheuten bij een 2,4-D concentratie lager dan 0.5 µM; grijs weefsel met onregelmatig oppervlak en enkel een heel beperkte hoeveelheid meris tematisch weefsel werd gevormd bij toevoegen van 0.1 to 1 µM 2,4-D; globules en nefaste zwartwording werden geobserveerd bij 0.5 µM 2, 4-D en hogere concentraties aan dit auxine. Gelijkaardige maar wat zwakk ere werking dan 2,4-D werd genoteerd voor Picloram. Inductie van vermeni gvuldiging uitgaande van scheuten met een lengte van 0.5 cm in plaats va n 0.1 cm, resulteerde in 2 tot 3 keer zoveel scheuten gevormd in 3 maand oude culturen. Op basis van het gemiddeld aantal scheuten en een algemene daling in sch eutlengte met stijgende cytokinine concentratie, selecteerden we scheute n met een lengte van 0.5 cm en 10 µM TDZ voor onze nieuwe methode o m MMC in banaan aan te maken. Naast de grootte van het uitgangsmateriaal (scheuten met lengte van 0.5 versus 1.5 cm) en de toegevoede PGR (10 µM TDZ versus 100 µM BAP), verschilde de nieuwe methode voor de ontwikkeling van banaan MMC van de klassieke procedure in de gebruikte container (Petrischalen versus glaz en proefbuizen), de hoeveelheid toegevoegd caseine hydrolysaat (500 mg/l versus 0 mg/l), stollingsmiddel in de kweekbodem (7 g/l Plan tagarâ versus 3 g/l Gelriteâ) en de lichtcondities (volledig donker versus voortdurend licht). Beide methodes werden toege past op 5 variëteiten, elk behorend tot een belangrijke groep in banaan. In vergelijking met de klassieke methode resulteerde het nieuwe protoco l in (i) een gelijke of hogere verhouding van meristematisch- ve rsus meer gedifferentieerd cormus- en bladweefsel en (ii) een reducti e van de vereiste tijd om MMC te ontwikkelen (van 1 tot 6 maand afhankel ijk van de gebruikte variëteit). Procambiale cellen in MMC leken minder georganiseerd in vaatbundelweefsel na TDZ- in vergelijking met BAP behan deling. Toch beïnvloedde dit methode-afhankelijk verschil de regeneratie capaciteit van de MMC niet. Planten werden opgegroeid van culturen die g edurende 11 maandelijkse kweekcycli onderhouden werden op graan-scheut- vermenigvuldigings - (GSV) voedingsbodem met ofwel 10 µM TDZ of 100 µM BAP. Bij deze planten werd op het eind van de aanpassingsperiod e in de serre minder dan 7% somaclonale variatie vastgesteld. De vergelijkende studie wat betreft het in vitro gedrag van banaan en maïs en de grootschalige studie over de invloed van cytoki nines en auxines op de ontwikkeling van banaanscheuten, leidde niet enke l tot een verbeterde methode voor het aanmaken van MMC. Dit onderzoek ve rrijkte ook onze kennis over de oorsprong van meervoudige scheuten in ba naan. We schuiven de hypothese naar voor waarin we stellen dat banaan ui terst weerbarstig is ten aanzien van adventieve scheutvorming. Nieuwvorm ing van scheuten wordt relatief gemakkelijk bekomen in veel eenzaadlobbi ge planten (waaronder maïs). In banaan daarentegen, werd nooit het vorme n van echt nieuwe scheuten geobserveerd, zelfs niet na het uittesten v an 242 verschillende PGR behandelingen. In plaats van echte nieuwvorming van scheuten krijgen we bij banaan eerder het uitgroeien van okselknopp en die al aanwezig waren in het geselecteerde uitgangsmateriaal. Het induceren van embryogenese in prolifererend weefsel (scalps) wordt g erapporteerd in Hoofdstuk 7. Tijdens een tijds-evolutie studie van geïnd uceerde scalps van Williams kwamen 3 reactiepatronen voor: geen embryo gene respons, individuele embryos en de aanwezigheid van ideale callus (bestaande uit embryogene callus met zwak samenhangende embryogene celg roepen en individuele embryos in een heel vroeg stadium van differentiat ie). De embryogene frequentie steeg 2 tot 4 keer wanneer culturen in het donker gehouden werden. Van de verschillende 2,4-D concentraties die ge test werden bij 5 variëteiten, elk behorend tot een belangrijke banaangr oep, resulteerde 5 µM 2,4-D in de gemiddeld hoogste embryogene freq uentie (14% van de geïnduceerde explanten). Het gebruik van TDZ in plaat s van BAP om de structuren te ontwikkelen die op hun beurt geïnduceerd w erden voor embryogenese, resulteerde in hogere embryogene frequenties (g emiddeld 9.4 versus 4.1%). Dit was voornamelijk te wijte n aan een hoger aantal geïnduceerde explanten die individuele embryos en compacte embryogene structuren vormden. Door een grootschalige toepassi ng van inductie van embryogenesis in BAP- en TDZ scalps (bij respectivel ijk 19 en 13 Musa variëteiten) werd aangetoond dat de embryog ene frequentie en aard van embryogene respons door prolifererend weefsel sterk afhankelijk was van de gebruikte banaanvariëteit. In tegenstellin g tot Hooglandbananen (AAAh groep) en de Wilde diploide variëteit Calcu tta (AA groep) die extreem recalcitrant waren, was inductie van embryog enese wel succesvol bij Musa balbisiana (BB groep), Plan tanen (AABp groep), Cavendish (AAA groep) en kookbananen (ABB groep). De gemiddelde embryogene frequentie onder bananentypes ontvankelijk voor e mbryogenese varieerde van 1.9 tot 18.1%. Algemeen viel een grote variati e in embryogene frequentie op, zelfs op het niveau van de variëteit. Id eale callus werd voornamelijk gevormd door Cavendish variëteiten. Hoofdstuk 8 handelt over de initiatie van embryogene celsuspensies (ECS) die succesvol toegepast werd op 14 variëteiten (behorende tot de AAA-, AAB-, ABB en BB groep). Dit hield een aanzienlijke uitbreiding in van de hoeveelheid materiaal beschikbaar voor genetische onderzoeksdoeleinden. Ongeveer een derde van de gevormde embryogene complexen gaf aanleiding tot ECS die voor meer dan 75% uit embryogene celgroepen bestonden. De ca paciteit van de geteste ECS om embryos te vormen was het laagst bij Agb agba [gemiddeld 0.36 x 105 embryos/ml bezonken cellen (BC)], hoger voor Williams en Gran enano (gemiddeld respectievelijk 1.48 en 1.79 x 105 embryos/ml BC en het hoogst voor Orishele (gemiddeld 4.66 x 105 embryos/ml BC). De gemiddelde frequentie van ontwikkeling van planten u it embryos was opmerkelijk hoger voor Plantanen (respectievelijk 9 en 8% voor Agbagba en Orishele ) vergeleken met Cavendish variëteiten (res pectievelijk 14 en 46% voor Gran enano en Williams ). De kwaliteit va n ECS verminderde gemiddeld tijdens de 2 jaar volgend op initiatie, zelf s wanneer de suspensies op heel regelmatige basis nagekeken werden en ni et regenereerbare structuren verwijderd. Na analyse door middel van flow -cytometrie werden in 5 van de 59 celsuspensie lijnen genetische afwijki ngen zoals mixoploïdie en polyploïdie vastgesteld. Deze genetische afwij kingen waren geassocieerd met een drastische vermindering in regeneratie capaciteit van de celculturen. Een studie van het groeigedrag van serrep lanten afkomstig van 64 celsuspensielijnen toonde aan dat 53% van de ECS - lijnen aanleiding gaf tot normale planten. Het grootste aantal abnorma le planten behoorde tot de Cavendish bananen en werd voornamelijk gekenm erkt door afwijkende bladpatronen en dwerggroei. Om na te gaan of de dikwijls voorkomende genotypische en/of genoomgroep afhankelijkheid van de in vitro respons (vastgesteld in Hoofdstukken 5 tot 8) gecorreleerd is met verschillende concentraties aa n endogene hormonen, werd de hoeveelheid isoprenoide cytokinines, vrije en geconjugeerde auxines bepaald in scheuten van in vitro < /&gt;bewortelde bananenplanten (gerapporteerd in Hoofdstuk 9). Algemeen war en actieve cytokinines, ribotides en dihydrozeatine-type cytokinines in lage concentratie aanwezig. In tegenstelling tot zeatin (Z)-type cytokin ines werd een overwicht van isopentenyladenine (iP)-type cytokinines vas tgesteld in geanalyseerde scheuten. Endogene concentraties aan zowel iP- type cytokinines als glucosides waren lager bij ABB variëteiten in verge lijking met variëteiten die het B-genoom niet dragen. De geanalyseerde c oncentraties endogene auxines varieerde sterk. Het totaal gehalte aan au xines en cytokinines gepresenteerd in Skoog en Miller diagramma s wees o p een genotypische en genoomgroep afhankelijke groepering van gegevens m et een lagere verhouding cyotkinine:auxine voor ABB variëteiten in verge lijking met variëteiten behorend tot de AA- of AAA groep. In Hoofdstuk 10 worden de algemene conclusies en vooruitzichten van dit werk voorgesteld.status: publishe

Sucrose preculture to simplify cryopreservation of banana meristem cultures

A simple cryopreservation method is. described for proliferating meristem cultures of banana (Musa spp.). It relies on a 2-week preculture on media containing 0.4 M sucrose followed by rapid cooling in liquid nitrogen. Different preculture media were screened for efficient protection of banana meristems during cryopreservation. Sucrose can be replaced by both fructose and glucose without significantly affecting post-thaw survival. A high BA concentration (100 muM) in the preculture medium results in less material available for cryopreservation, but does not affect cryoprotection. Culture in liquid media significantly improved post-thaw regeneration. The optimized cryopreservation protocol was applied on 36 banana accessions belonging to 8 different genomic groups. It is shown that post-thaw regeneration frequencies (ranging between 0 and 66%) are highly dependent on the genomic constitution of the banana cultivar

Transgenic approaches for resistance to mycosphaerella leaf spot diseases in musa spp

Abstract: In smallholdings, average banana and plantain yields per unit have not increased significantly in the last 30 years. Increases in production are due almost exclusively to an increase in the area under cultivation. Increasing pest and disease pressure, especially from leaf spot diseases, and the deteriorating natural resource base have collectively been responsible for these low yields. Resistant high yielding bananas have been bred and supplied to smallholders in the 1990s after nearly 70 years of conventional breeding. This very slow progress was due to the high sterility, poor seed germination rate, need for interploidy crosses, the long generation cycle, which are inherent to bananas and plantains. A breeding program can only supply a few promising hybrids per year for further evaluation. The few selected hybrids are high yielding and resistant to some diseases but have usually lost other desired characteristics such as shelf life or pulp texture. Genetic transformation tools offer an opportunity for plant breeders to overcome the constraints imposed by the high level of sterility of the most popular cultivars. Good progress has been made in the development of a molecular toolbox for bananas and plantains in the areas of 1) cell suspension, 2) genetic transformation (particle bombardment and Agrobacteriummediated transformation),3) high expression of foreign genes,4) insertion of multiple genes and 5) identification of genes for resistance to fungal disease. Resumen: Enfoques transgénicos para la resistencia a las enfermedades de las manchas foliares en banano (Musa spp.) Durante los últimos 30 años, los rendimientos promedio de los bananos y plátanos no han aumentado significativamente en las pequeñas fincas y los aumentos de producción se deben casi exclusivamente a un aumento del área bajo cultivo. El aumento de la presión de plagas y enfermedades, especialmente de las enfermedades de las manchas foliares, y el deterioro de la base de recursos naturales han sido responsables de manera colectiva de estos rendimientos tan bajos. En la década de los 90,se seleccionaron bananos resistentes de alto rendimiento los cuales fueron suministrados a los pequeños productores, después de casi 70 años de mejoramiento convencional. Este progreso tan lento se debió a una alta esterilidad, una tasa pobre de germinación de las semillas, una necesidad de cruzamientos interploídicos, un largo ciclo de regeneración, etc., inherentes a los bananos y plátanos. Básicamente, un programa de mejoramiento puede proporcionar solo unos pocos híbridos prometedores por año para realizar las evaluaciones consiguientes. Los pocos híbridos seleccionados son de alto rendimiento y resistentes a algunas enfermedades,pero usualmente pierden otras características deseadas como vida verde, textura de la pulpa, etc. Las herramientas de la transformación genética ofrecen una oportunidad a los fitomejoradores para vencer las limitaciones impuestas por el alto nivel de esterilidad en las variedades más populares. También se alcanzó un buen progreso en el desarrollo de una serie de herramientas moleculares para los bananos y plátanos en las áreas de (1) desarrollo de las suspensiones celulares; (2) tecnologías de transformación genética (bombardeo con partículas o transformación con Agrobacterium); (3) alta expresión de genes foráneos; (4) inserción de genes múltiples; (5) identificación de genes para la resistencia a enfermedades fungosas. Résumé: Approches transgéniques de la résistance aux maladies foliaires causées par les Mycosphaerella chez les Musa spp. Dans les exploitations de petite taille, les rendements en bananes et bananes plantain n’ont pas significativement augmenté au cours des 30 dernières années. L’augmentation de la production est due presque exclusivement à une augmentation de la surface cultivée.L’accroissement de la pression des maladies et ravageurs, et particulièrement des maladies foliaires, et la détérioration de la base de la ressource naturelle ont été collectivement responsables de ces faibles rendements. Des bananiers résistants et à rendement élevé ont été produits et distribués aux petits producteurs dans les années 90, après près de 70 ans d’amélioration conventionnelle. Ces progrès très lents sont dus à la stérilité élevée,au faible taux de germination des semences,au besoin de réaliser des croisements interploïdes et au long cycle de génération, qui sont propres aux bananiers et aux bananiers plantain. Un programme d’amélioration ne peut produire que quelques hybrides prometteurs par an pour leur évaluation ultérieure. Les quelques hybrides sélectionnés ont une production élevée et sont résistants à certaines maladies mais ont généralement perdu d’autres caractéristiques désirées, telles que la durée de conservation ou la texture de la pulpe. Les outils de transformation génétique offrent une opportunité aux sélectionneurs de surmonter les contraintes imposées par le niveau élevé de stérilité des cultivars les plus populaires.Des progrès importants ont été faits dans le développement d’une boîte à outils moléculaires pour les bananiers et les bananiers plantain dans les domaines : 1) des suspensions cellulaires ; 2) de la transformation génétique (bombardement de particules et transformation avec Agrobacterium ; 3) du niveau d’expression élevé de gènes étrangers ; 4) de l’insertion de gènes multiples et 5) de l’identification de gènes de résistance aux maladies fongiques.Laboratory of Tropical Crop Improvement, Katholieke Universiteit Leuven