Etudes phylogénomiques et moléculaires des hélicases de type Lhr chez les Archaea et les bactéries

Les hélicases, classées en six superfamilles (SF1-6), sont des protéines qui utilisent l'énergie de l'ATP pour dérouler les acides nucléiques et pour remodeler les complexes protéines-acides nucléiques. Elles sont impliquées dans presque tous les aspects du métabolisme de l'ADN et de l'ARN en participant à de nombreux mécanismes de maintien de l'intégrité cellulaire. Les protéines de type Lhr sont des hélicases SF2 qui sont pour la plupart non caractérisées. Récemment, par des approches phylogénomiques, Dr H. Chamieh et ses collaborateurs ont classé toutes les hélicases SF1 et SF2 présentes dans les génomes d'Archaea et ont montré que les protéines de type Lhr sont ubiquitaires (Chamieh et al. 2016). De plus, en déterminant les réseaux d'interaction des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, comme la ribonucléase aRNase J et l'hélicase ASH-Ski2, Dr B. Clouet-d'Orval et ses collaborateurs ont identifié un lien entre les machines de traduction, de dégradation de l'ARN et de transcription chez les Thermococcales -archaea hyperthermophile- avec, au sein de ces réseaux, une protéine annotée comme une hélicase de type Lhr (Phung et al. 2020). Dans ce contexte, les travaux de ma thèse ont pour objectif d'effectuer des analyses phylogénomiques approfondies des hélicases de type Lhr chez les archées et les bactéries, de disséquer la fonction moléculaire de aLhr2 chez Thermococcus barophilus, organisme modèle pour les études biochimiques et génétiques chez les Thermococcales, et d'étudier le rôle de l'hélicase Lhr de E. coli où le gène lhr est en opéron avec le gène codant pour la RNase T. Dans une première partie, une étude bibliographique (publication d'un chapitre de livre ; Hajj et al, 2019) et des analyses phylogénomiques ont permis de définir les protéines de type Lhr comme ubiquitaire chez les archées et d'identifier cinq groupes d'orthologues. Ces analyses permettent de proposer un chemin évolutif pour les protéines Lhr d'archées et de bactéries et d'émettre des hypothèses sur leurs fonctions dans la cellule (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur l'étude moléculaire de aLhr2 de Thermococcus barophilus (Tbar). Pour étudier les activités enzymatiques de Tbar-aLhr2, le gène alhr2 a été cloné et la protéine recombinante Tbar-aLhr2 exprimée à l'aide du système d'expression pET chez E. coli. Nous avons démontré que Tbar-aLhr2 est une ATPase avec une affinité similaire pour l'ADN et l'ARN simple brin qui peut spécifiquement former et dérouler des duplex ADN/ARN avec une extrémité 3' sortante. Enfin, nous avons effectué des analyses protéomiques et transcriptomiques pour identifier le réseau de protéines associées à Tbar-aLhr2 et pour déterminer l'impact de la délétion du gène alhr2 (Δalhr2) sur l'expression génique chez T. barophilus. Au regard de ces résultats, nous proposons que Tbar-aLhr2 est impliqué au niveau de la transcription et/ou de la réparation de l'ADN chez les Thermococcales en agissant au niveau des "R-loop" (duplex ARN/ADN) (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une troisième partie, nous avons initié une étude fonctionnelle de l'hélicase bLhr de E. coli (Eco). Pour tester l'interaction entre Eco-bLhr et la RNase T qui sont exprimées au sein d'un même opéron, le gène Eco-blhr a été cloné et la protéine recombinante Eco-bLhr exprimée. La RNase T est une ribonucléase connue pour être impliquée dans la réparation de l'ADN et le métabolisme des ARNt et ARNr. Finalement, une discussion permet de comparer le(s) rôle(s) proposé(s) pour les hélicases de type Lhr chez les bactéries et les archées en dégageant l'ARN comme acteur clé dans la réparation des dommages de l'ADN.Helicases are proteins that use ATP energy to unwind nucleic acids and to remodel protein-nucleic acid complexes. They are involved in almost every aspect of the DNA and RNA metabolism and participate in numerous repair mechanisms maintaining cellular integrity. Helicases are classified into six superfamilies (SF1-6). The Lhr-type proteins belong to SF2 helicases that are poorly characterized to date. A phylogenomic study performed by Chamieh et al classified SF1 and SF2 helicases from archaeal sequenced genomes and showed that Lhr-type proteins are ubiquitous in Archaea (Chamieh et al. 2016). Another study conducted by Clouet D'orval et al, determined the interaction networks of proteins involved in RNA metabolism, such as the ribonuclease aRNase J and the helicase ASH-Ski2, they identified a cross-talk between the translation, RNA degradation and transcription machineries in Thermococcales a group of -hyperthermophilic Archaea- and remarkably Lhr-type helicase was found to be a partner in these networks (Phung et al. 2020). In this context, my PhD thesis aim to perform in-depth phylogenomic analyses of Lhr-type helicases in Archaea and to extend this work further to bacteria, to dissect the molecular function of aLhr2 in Thermococcus barophilus, a model organism used for biochemical and genetic studies in Thermococcales. Further, we aim to investigate the role of the bacterial Lhr (bLhr) helicase in E.coli where the gene is co-transcribed with the RNase T in proteobacteria. The first part of our work was initiated with a bibliographic survey (published book chapter; Hajj et al, 2019)/ followed by phylogenomic studies on the Lhr-type proteins. We were able to define the Lhr-type proteins as ubiquitous enzyme in Archaea and identify five orthologous groups. Based on these analyses, we proposed an evolution route for the five archaeal and bacterial Lhr groups and hypothesize on their functions in the cell (Hajj et al, Manuscript in preparation). In a second part, we focused on the molecular study of aLhr2 from Thermococcus barophilus (Tbar). To investigate the enzymatic activities of Tbar-aLhr2, alhr2 gene was cloned and the recombinant protein recombinant Tbar-aLhr2 protein produced using the pET expression system in E. coli. We demonstrated that Tbar-aLhr2 is an ATPase that has the same affinity for single stranded DNA and RNA and can specifically anneal and unwind DNA/RNA duplex with a 3' overhang. Finally, proteomic and transcriptomic analyses were performed to identify Tbar-aLhr2 protein network and to determine the effect of lhr2 deletion (Δlhr2) on gene expressions in T. barophilus. In light of all these results, we propose that Tbar-aLhr2 is involved in transcription or/and DNA repair in Thermococcales and acts on R-loops (RNA/DNA duplex) (Hajj et al, Manuscript in preparation). In the third part of the work, we initiated a functional study of the bLhr helicase of E. coli (Eco). To examine a putative interaction between Eco-bLhr and RNase T that are expressed as an operon, the Eco-blhr gene was cloned and the recombinant Eco-bLhr protein produced. RNase T is a ribonuclease known to be involved in DNA repair and tRNA/rRNA metabolism. Finally, we discussed and compared the putative role(s) of Lhr helicases in Bacteria and Archaea in RNA metabolism and DNA repair in eliciting RNA as a key player in the repair of DNA damage

Phylogenomics & Molecular studies of Lhr-type SF2 helicases in Archaea and Bacteria

Les hélicases, classées en six superfamilles (SF1-6), sont des protéines qui utilisent l'énergie de l'ATP pour dérouler les acides nucléiques et pour remodeler les complexes protéines-acides nucléiques. Elles sont impliquées dans presque tous les aspects du métabolisme de l'ADN et de l'ARN en participant à de nombreux mécanismes de maintien de l'intégrité cellulaire. Les protéines de type Lhr sont des hélicases SF2 qui sont pour la plupart non caractérisées. Récemment, par des approches phylogénomiques, Dr H. Chamieh et ses collaborateurs ont classé toutes les hélicases SF1 et SF2 présentes dans les génomes d'Archaea et ont montré que les protéines de type Lhr sont ubiquitaires (Chamieh et al. 2016). De plus, en déterminant les réseaux d'interaction des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, comme la ribonucléase aRNase J et l'hélicase ASH-Ski2, Dr B. Clouet-d'Orval et ses collaborateurs ont identifié un lien entre les machines de traduction, de dégradation de l'ARN et de transcription chez les Thermococcales -archaea hyperthermophile- avec, au sein de ces réseaux, une protéine annotée comme une hélicase de type Lhr (Phung et al. 2020). Dans ce contexte, les travaux de ma thèse ont pour objectif d'effectuer des analyses phylogénomiques approfondies des hélicases de type Lhr chez les archées et les bactéries, de disséquer la fonction moléculaire de aLhr2 chez Thermococcus barophilus, organisme modèle pour les études biochimiques et génétiques chez les Thermococcales, et d'étudier le rôle de l'hélicase Lhr de E. coli où le gène lhr est en opéron avec le gène codant pour la RNase T. Dans une première partie, une étude bibliographique (publication d'un chapitre de livre ; Hajj et al, 2019) et des analyses phylogénomiques ont permis de définir les protéines de type Lhr comme ubiquitaire chez les archées et d'identifier cinq groupes d'orthologues. Ces analyses permettent de proposer un chemin évolutif pour les protéines Lhr d'archées et de bactéries et d'émettre des hypothèses sur leurs fonctions dans la cellule (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur l'étude moléculaire de aLhr2 de Thermococcus barophilus (Tbar). Pour étudier les activités enzymatiques de Tbar-aLhr2, le gène alhr2 a été cloné et la protéine recombinante Tbar-aLhr2 exprimée à l'aide du système d'expression pET chez E. coli. Nous avons démontré que Tbar-aLhr2 est une ATPase avec une affinité similaire pour l'ADN et l'ARN simple brin qui peut spécifiquement former et dérouler des duplex ADN/ARN avec une extrémité 3' sortante. Enfin, nous avons effectué des analyses protéomiques et transcriptomiques pour identifier le réseau de protéines associées à Tbar-aLhr2 et pour déterminer l'impact de la délétion du gène alhr2 (Δalhr2) sur l'expression génique chez T. barophilus. Au regard de ces résultats, nous proposons que Tbar-aLhr2 est impliqué au niveau de la transcription et/ou de la réparation de l'ADN chez les Thermococcales en agissant au niveau des "R-loop" (duplex ARN/ADN) (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une troisième partie, nous avons initié une étude fonctionnelle de l'hélicase bLhr de E. coli (Eco). Pour tester l'interaction entre Eco-bLhr et la RNase T qui sont exprimées au sein d'un même opéron, le gène Eco-blhr a été cloné et la protéine recombinante Eco-bLhr exprimée. La RNase T est une ribonucléase connue pour être impliquée dans la réparation de l'ADN et le métabolisme des ARNt et ARNr. Finalement, une discussion permet de comparer le(s) rôle(s) proposé(s) pour les hélicases de type Lhr chez les bactéries et les archées en dégageant l'ARN comme acteur clé dans la réparation des dommages de l'ADN.Helicases are proteins that use ATP energy to unwind nucleic acids and to remodel protein-nucleic acid complexes. They are involved in almost every aspect of the DNA and RNA metabolism and participate in numerous repair mechanisms maintaining cellular integrity. Helicases are classified into six superfamilies (SF1-6). The Lhr-type proteins belong to SF2 helicases that are poorly characterized to date. A phylogenomic study performed by Chamieh et al classified SF1 and SF2 helicases from archaeal sequenced genomes and showed that Lhr-type proteins are ubiquitous in Archaea (Chamieh et al. 2016). Another study conducted by Clouet D'orval et al, determined the interaction networks of proteins involved in RNA metabolism, such as the ribonuclease aRNase J and the helicase ASH-Ski2, they identified a cross-talk between the translation, RNA degradation and transcription machineries in Thermococcales a group of -hyperthermophilic Archaea- and remarkably Lhr-type helicase was found to be a partner in these networks (Phung et al. 2020). In this context, my PhD thesis aim to perform in-depth phylogenomic analyses of Lhr-type helicases in Archaea and to extend this work further to bacteria, to dissect the molecular function of aLhr2 in Thermococcus barophilus, a model organism used for biochemical and genetic studies in Thermococcales. Further, we aim to investigate the role of the bacterial Lhr (bLhr) helicase in E.coli where the gene is co-transcribed with the RNase T in proteobacteria. The first part of our work was initiated with a bibliographic survey (published book chapter; Hajj et al, 2019)/ followed by phylogenomic studies on the Lhr-type proteins. We were able to define the Lhr-type proteins as ubiquitous enzyme in Archaea and identify five orthologous groups. Based on these analyses, we proposed an evolution route for the five archaeal and bacterial Lhr groups and hypothesize on their functions in the cell (Hajj et al, Manuscript in preparation). In a second part, we focused on the molecular study of aLhr2 from Thermococcus barophilus (Tbar). To investigate the enzymatic activities of Tbar-aLhr2, alhr2 gene was cloned and the recombinant protein recombinant Tbar-aLhr2 protein produced using the pET expression system in E. coli. We demonstrated that Tbar-aLhr2 is an ATPase that has the same affinity for single stranded DNA and RNA and can specifically anneal and unwind DNA/RNA duplex with a 3' overhang. Finally, proteomic and transcriptomic analyses were performed to identify Tbar-aLhr2 protein network and to determine the effect of lhr2 deletion (Δlhr2) on gene expressions in T. barophilus. In light of all these results, we propose that Tbar-aLhr2 is involved in transcription or/and DNA repair in Thermococcales and acts on R-loops (RNA/DNA duplex) (Hajj et al, Manuscript in preparation). In the third part of the work, we initiated a functional study of the bLhr helicase of E. coli (Eco). To examine a putative interaction between Eco-bLhr and RNase T that are expressed as an operon, the Eco-blhr gene was cloned and the recombinant Eco-bLhr protein produced. RNase T is a ribonuclease known to be involved in DNA repair and tRNA/rRNA metabolism. Finally, we discussed and compared the putative role(s) of Lhr helicases in Bacteria and Archaea in RNA metabolism and DNA repair in eliciting RNA as a key player in the repair of DNA damage

EAD, contribution à la modélisation de systèmes d'évaluation pédagogique utilisant les TIC, implémentation dans un environnement Web-XML

Dans ce mémoire, nous proposons un modèle conceptuel inspiré du formalisme d automate pour le processus d évaluation pédagogique. Nous avons prouvé que le formalisme d automate permet de décrire l interaction apprenant-système et la structure de questionnaires dirigés, conçus sous forme de graphes de tests étiquetés par des réponses. L un des avantages du modèle d automate est son extensibilité puisqu il permet d intégrer toutes les caractéristiques d évaluation telles que le score. D autre part, nous avons élaboré une méthode de conception de systèmes d évaluation qui permet de réaliser deux bibliothèques de documents XML et de feuilles de style XSL à partir de styles de tests. De plus, une architecture à 4 couches pour les plate-formes EAD a été introduite où les couches d évaluation et d apprentissage sont des automates. Finalement, le travail fourni dans ce mémoire, contribue à une standardisation de la structure de questionnaires dirigés qui complètera la norme IMS pour les testsIn this thesis, we propose a conceptual model inspired of the automaton formalism for the educational assessment process. We proved that the automaton formalism permits to describe the learner-system interaction and the structure of directed questionnaires, conceived under shape of graphs of tests labeled by answers. One of the advantages of the automaton model is its extensibility since it permits to integrate all features of assessment as the score. On the other hand, we elaborate a method of conception of assessment systems that essentially shows how to realize two libraries of XML documents and XSL style sheets from tests styles. Moreover, a layered architecture for E-learning platforms has been introduced where the layers of assessment and learning are two automata communicating by messages. Finally, the work provided in this thesis, contribute towards the standardization of the directed questionnaires structure that completes the IMS standard for the testsST DENIS-BU PARIS8 (930662101) / SudocSudocFranceF

Un modèle d’automate pour le processus d’évaluation pédagogique : Génération d’un langage AML (Automata MarkUp Language)

International audienc

A multi-layers model for E-learning platforms

International audienc

Phylogenetic Diversity of Lhr Proteins and Biochemical Activities of the Thermococcales aLhr2 DNA/RNA Helicase

International audienceHelicase proteins are known to use the energy of ATP to unwind nucleic acids and to remodel protein-nucleic acid complexes. They are involved in almost every aspect of DNA and RNA metabolisms and participate in numerous repair mechanisms that maintain cellular integrity. The archaeal Lhr-type proteins are SF2 helicases that are mostly uncharacterized. They have been proposed to be DNA helicases that act in DNA recombination and repair processes in Sulfolobales and Methanothermobacter. In Thermococcales, a protein annotated as an Lhr2 protein was found in the network of proteins involved in RNA metabolism. To investigate this, we performed in-depth phylogenomic analyses to report the classification and taxonomic distribution of Lhr-type proteins in Archaea, and to better understand their relationship with bacterial Lhr. Furthermore, with the goal of envisioning the role(s) of aLhr2 in Thermococcales cells, we deciphered the enzymatic activities of aLhr2 from Thermococcus barophilus (Tbar). We showed that Tbar-aLhr2 is a DNA/RNA helicase with a significant annealing activity that is involved in processes dependent on DNA and RNA transactions