Erzeugung und Charakterisierung zielgerichteter liposomaler Trägersysteme für die Tumortherapie

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, drei neue liposomale Systeme für die zielgerichtete Tumortherapie zu entwickeln. Dafür wurden liposomale Oberflächen mit Zielsteuerungsmotiven, die mittels der Phage-Display-Technologie erzeugt wurden, modifiziert. Für das vaskuläre Targeting wurden als Liganden ein gegen Endoglin gerichtetes humanes scFv-Fragment und ein gegen die alpha-v-Integrine gerichtetes RGD-Peptid verwendet. Als Zielsteuerungsmotiv für den auf Tumorzellen lokalisierten EGF-Rezeptor diente ein derivatisiertes humanes EGF-Protein. Während das scFv-Fragment über eine Thioetherbindung an Maleimid-haltige Liposomen und das EGF-Protein über eine Carbonsäureamidbindung an N-hydroxysuccinimid-haltige Liposomen gerichtet gekoppelt werden konnte, wurde das RGD-Peptid als Lipopeptid in die liposomale Membran integriert. Die liposomalen Systeme wurden zuerst physiko-chemisch analysiert. Mittels in vitro-Studien konnte demonstriert werden, daß alle drei zielgerichteten liposomalen Systeme selektiv an die jeweiligen Zielzellen gebunden haben und von diesen aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurde durch Kompetitionsexperimente nachgewiesen, daß die Bindung an die Zielzellen bzw. die Aufnahme in diese spezifisch über den jeweiligen Liganden vermittelt wurde. Die mit dem scFv-Fragment modifizierten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen zeigten im Vergleich zu den gleichen Liposomen ohne Zielsteuerungsmotiv eine erhöhte in vitro-Zytotoxizität. Die gegen die alpha-v-Integrine gerichteten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen konnten auch im Tierversuch das Tumorwachstum - verglichen mit den gleichen nicht-zielgerichteten Liposomen - stärker inhibieren. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde erfolgreich das Zytostatikum Cytarabin in eine neue liposomale Formulierung verpackt. Mittels dieser Liposomen konnte - verglichen mit freiem Cytarabin - eine signifikant verstärkte Inhibierung des Tumorwachstums im Tierversuch nachgewiesen werden

Erzeugung und Charakterisierung zielgerichteter liposomaler Trägersysteme für die Tumortherapie

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, drei neue liposomale Systeme für die zielgerichtete Tumortherapie zu entwickeln. Dafür wurden liposomale Oberflächen mit Zielsteuerungsmotiven, die mittels der Phage-Display-Technologie erzeugt wurden, modifiziert. Für das vaskuläre Targeting wurden als Liganden ein gegen Endoglin gerichtetes humanes scFv-Fragment und ein gegen die alpha-v-Integrine gerichtetes RGD-Peptid verwendet. Als Zielsteuerungsmotiv für den auf Tumorzellen lokalisierten EGF-Rezeptor diente ein derivatisiertes humanes EGF-Protein. Während das scFv-Fragment über eine Thioetherbindung an Maleimid-haltige Liposomen und das EGF-Protein über eine Carbonsäureamidbindung an N-hydroxysuccinimid-haltige Liposomen gerichtet gekoppelt werden konnte, wurde das RGD-Peptid als Lipopeptid in die liposomale Membran integriert. Die liposomalen Systeme wurden zuerst physiko-chemisch analysiert. Mittels in vitro-Studien konnte demonstriert werden, daß alle drei zielgerichteten liposomalen Systeme selektiv an die jeweiligen Zielzellen gebunden haben und von diesen aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurde durch Kompetitionsexperimente nachgewiesen, daß die Bindung an die Zielzellen bzw. die Aufnahme in diese spezifisch über den jeweiligen Liganden vermittelt wurde. Die mit dem scFv-Fragment modifizierten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen zeigten im Vergleich zu den gleichen Liposomen ohne Zielsteuerungsmotiv eine erhöhte in vitro-Zytotoxizität. Die gegen die alpha-v-Integrine gerichteten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen konnten auch im Tierversuch das Tumorwachstum - verglichen mit den gleichen nicht-zielgerichteten Liposomen - stärker inhibieren. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde erfolgreich das Zytostatikum Cytarabin in eine neue liposomale Formulierung verpackt. Mittels dieser Liposomen konnte - verglichen mit freiem Cytarabin - eine signifikant verstärkte Inhibierung des Tumorwachstums im Tierversuch nachgewiesen werden

Automated Clinical Grade Expansion of Regulatory T Cells in a Fully Closed System

Adoptive transfer of T regulatory cells (Treg) has been successfully exploited in the context of graft-versus-host disease, transplantation, and autoimmune disease. For the majority of applications, clinical administration of Treg requires laborious ex vivo expansion and typically involves open handling for culture feeds and repetitive sampling. Here we show results from our approach to translate manual Treg manufacturing to the fully closed automated CliniMACS Prodigy® system reducing contamination risk, hands-on time, and quality variation from human intervention. Polyclonal Treg were isolated from total nucleated cells obtained through leukapheresis of healthy donors by CD8+ cell depletion and subsequent CD25high enrichment. Treg were expanded with the CliniMACS Prodigy® device using clinical-grade cell culture medium, rapamycin, IL-2, and αCD3/αCD28 beads for 13–14 days. We successfully integrated expansion bead removal and final formulation into the automated procedure, finalizing the process with a ready to use product for bedside transfusion. Automated Treg expansion was conducted in parallel to an established manual manufacturing process using G-Rex cell culture flasks. We could prove similar expansion kinetics leading to a cell yield of up to 2.12 × 109 cells with the CliniMACS Prodigy® and comparable product phenotype of >90% CD4+CD25highCD127lowFOXP3+ cells that had similar in vitro immunosuppressive function. Efficiency of expansion bead depletion was comparable to the CliniMACS® Plus system and the final ready-to-infuse product had phenotype stability and high vitality after overnight storage. We anticipate this newly developed closed system expansion approach to be a starting point for the development of enhanced throughput clinical scale Treg manufacture, and for safe automated generation of antigen-specific Treg grafted with a chimeric antigen receptor (CAR Treg)