Mechanisms leading to overexpression of 1,25-Dihydroxyvitamin D3-24-Hydroxylase in colorectal cancer

Ausreichende Serumkonzentrationen von Vitamin D werden mit einem reduzierten Kolorektalkrebsrisiko assoziiert. 1,25- Dihydroxyvitamin D3 (auch als Calcitriol bezeichnet) ist die hormonell aktive Form von Vitamin D. Die Serumkonzentration von Calcitriol wird durch die Nieren streng reguliert, da Calcitriol eine wichtige Rolle in der Regulation der Kalziumhomöostase und Knochenmineralisierung spielt. In anderen Geweben synthetisiertes Calcitriol hat autokrine/parakrine Funktionen und kontrolliert Zellproliferation, Apoptose, Angiogenese und Zelldifferenzierung. Calcitriol wird durch das Enzym 1,25- Dihydroxyvitamin D3 24-Hydroxylase (CYP24A1) abgebaut. Dieses Enzym ist in Kolonadenomen und -adenokarzinomen stark erhöht. Dies führt lokal wahrscheinlich zu einem raschen Abbau von Calcitriol, wodurch dessen anti-tumorigene Wirkung limitiert wird und einen Wachstumsvorteil für den Tumor zur Folge hat. Diese Dissertation hat es zum Ziel, die Ursachen und Wirkungen der erhöhten CYP24A1 Expression in humanen Darmkrebsproben zu ergründen, da dieses Enzym eine wichtige Rolle beim Abbau der aktiven Vitamin D Metaboliten spielt. Zu den untersuchten Ursachen einer CYP24A1 Überexpression zählen DNA Methylierung untersucht mit Hilfe von Bisulfit-Sequenzierung, Änderungen der CYP24A1-Kopienzahl durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und q-PCR, Änderungen der transkriptionellen Regulation bestimmt durch qRT-PCR und letztendlich K- RAS Mutationen untersucht durch Datenbankanalyse. Als Untersuchungsmaterial dienten sowohl humane Darmkrebsproben und umliegendes Schleimhautgewebe als auch humane Darmzelllinien. Es konnte gezeigt werden, dass Chromosom 20 Polysomien und erhöhte CYP24A1- Kopienzahl zu einer erhöhten Expression des Gens führen. Des Weiteren konnten epigenetische Änderungen in der Promoterregion von CYP24A1 und K-RAS Mutationen als Ursachen für erhöhte Expression ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse deuten auf einen Verbindung zwischen erhöhter CYP24A1 Expression und erhöhtem Tumorwachstum hin.Sufficient vitamin D serum levels are associated with reduced risk of colorectal cancer. Calcitriol or 1,25-dihydroxyvitamin D3 is the hormonally active form of vitamin D. Calcitriol serum levels are tightly controlled by the kidneys as it plays an important role in the systemic regulation of calcium homeostasis and bone mineralization. Calcitriol synthesized in extra-renal tissues acts in a paracrine/autocrine manner controlling cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and differentiation. It is degraded by the enzyme 1,25-dihydroxyvitamin D3 24- hydroxylase (CYP24A1). This enzyme is overexpressed in colon adenomas and adenocarcinomas. High basal CYP24A1 expression likely depletes local calcitriol levels, thereby rendering its anti-tumorigenic function inactive and possibly providing a growth advantage for tumors. This thesis aims to determine the causes and consequences of CYP24A1 overexpression in colorectal tumors because CYP24A1 plays an important role in the degradation of the active vitamin D metabolites. Possible causes of CYP24A1 overexpression investigated in this thesis include DNA methylation by bisulfite sequencing, CYP24A1 copy number alterations by fluorescence in situ hybridization and q-PCR, alterations in transcriptional regulation by qRT-PCR, and K-RAS mutations by data- mining in databases. Human tumor samples and adjacent mucosa as well as human colon cancer cell lines served as study material. In this thesis, chromosome 20 polysomy and CYP24A1 copy number alterations were determined as causes of CYP24A1 overexpression in colorectal tumors. Further, epigenetic alterations in the CYP24A1 promoter as well as K-RAS mutations could be excluded as causes of altered gene expression. This thesis provides first evidence that increased CYP24A1 expression is linked to highly proliferative tumors.eingericht von Julia HöbausAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2013OeBB(VLID)171391

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research / The calcium-sensing receptor : A promising target for prevention of colorectal cancer

The inverse correlation between dietary calcium intake and the risk of colorectal cancer (CRC) is well known, but poorly understood. Expression of the calcium-sensing receptor (CaSR), a calcium-binding G protein-coupled receptor is downregulated in CRC leading us to hypothesize that the CaSR has tumor suppressive roles in the colon. The aim of this study was to understand whether restoration of CaSR expression could reduce the malignant phenotype in CRC. In human colorectal tumors, expression of the CaSR negatively correlated with proliferation markers whereas loss of CaSR correlated with poor tumor differentiation and reduced apoptotic potential. In vivo, dearth of CaSR significantly increased expression of proliferation markers and decreased levels of differentiation and apoptotic markers in the colons of CaSR/PTH double knock-out mice confirming the tumor suppressive functions of CaSR. In vitro CRC cells stably overexpressing wild-type CaSR showed significant reduction in proliferation, as well as increased differentiation and apoptotic potential. The positive allosteric modulator of CaSR, NPS R-568 further enhanced these effects, whereas treatment with the negative allosteric modulator, NPS 2143 inhibited these functions. Interestingly, the dominant-negative mutant (R185Q) was able to abrogate these effects. Our results demonstrate a critical tumor suppressive role of CaSR in the colon. Restoration of CaSR expression and function is linked to regulation of the balance between proliferation, differentiation, and apoptosis and provides a rationale for novel strategies in CRC therapy.(VLID)488793