Removal of Giα1 Constraints on Adenylyl Cyclase in the Hippocampus Enhances LTP and Impairs Memory Formation

AbstractStimulation of adenylyl cyclase in the hippocampus is critical for memory formation. However, generation of cAMP signals within an optimal range for memory may require a balance between stimulatory and inhibitory mechanisms. The role of adenylyl cyclase inhibitory mechanisms for memory has not been addressed. One of the mechanisms for inhibition of adenylyl cyclase is through activation of Gi-coupled receptors, a mechanism that could serve as a constraint on memory formation. Here we report that ablation of Giα1 by gene disruption increases hippocampal adenylyl cyclase activity and enhances LTP in area CA1. Furthermore, gene ablation of Giα1 or antisense oligonucleotide-mediated depletion of Giα1 disrupted hippocampus-dependent memory. We conclude that Giα1 provides a critical mechanism for tonic inhibition of adenylyl cyclase activity in the hippocampus. We hypothesize that loss of Giα1 amplifies the responsiveness of CA1 postsynaptic neurons to stimuli that strengthen synaptic efficacy, thereby diminishing synapse-specific plasticity required for new memory formation

Differential regulation of lipopolysaccharide and Gram-positive bacteria induced cytokine and chemokine production in splenocytes by Gαi proteins

AbstractHeterotrimeric Gi proteins play a role in lipopolysaccharide (LPS) and Staphylococcus aureus (SA) activated signaling leading to inflammatory mediator production. We hypothesized that genetic deletion of Gi proteins would alter cytokine and chemokine production induced by LPS and SA. LPS- and heat killed SA-induced cytokine and chemokine production in splenocytes from wild type (WT), Gαi2 (−/−) or Gαi1/3 (−/−) mice were investigated. LPS- or SA-induced production of TNFα, IL-6, IFNγ, IL-12, IL-17, GM-CSF, MIP-1α, MCP-1, MIG and IP-10 were significantly increased (1.2 to 33 fold, p<0.05) in splenocytes harvested from Gαi2(−/−) mice compared with WT mice. The effect of Gαi protein depletion was remarkably isoform specific. In splenocytes from Gαi1/3 (−/−) mice relative to WT mice, SA-induced IL-6, IFNγ, GM-CSF, and IP-10 levels were decreased (59% to 86%, p<0.05), whereas other LPS- or SA-stimulated cytokines and chemokines were not different relative to WT mice. LPS- and SA-induced production of KC were unchanged in both groups of the genetic deficient mice. Splenocytes from both Gαi2 (−/−) and Gαi1/3 (−/−) mice did not exhibit changes in TLR2 and TLR4 expression. Also analysis of splenic cellular composition by flow cytometry demonstrated an increase in splenic macrophages and reduced CD4 T cells in both Gαi2 (−/−) and Gαi1/3 (−/−) mice relative to WT mice. The disparate response of splenocytes from the Gαi2 (−/−) relative to Gαi1/3 (−/−) mice therefore cannot be attributed to major differences in spleen cellular composition. These data demonstrate that Gi2 and Gi1/3 proteins are both involved and differentially regulate splenocyte inflammatory cytokine and chemokine production in a highly Gi isoform specific manner in response to LPS and Gram-positive microbial stimuli

The Serine 814 of TRPC6 Is Phosphorylated under Unstimulated Conditions

TRPC are nonselective cation channels involved in calcium entry. Their regulation by phosphorylation has been shown to modulate their routing and activity. TRPC6 activity increases following phosphorylation by Fyn, and is inhibited by protein kinase G and protein kinase C. A previous study by our group showed that TRPC6 is phosphorylated under unstimulated conditions in a human embryonic kidney cells line (HEK293). To investigate the mechanism responsible for this phosphorylation, we used a MS/MS approach combined with metabolic labeling and showed that the serine at position 814 is phosphorylated in unstimulated cells. The mutation of Ser814 into Ala decreased basal phosphorylation but did not modify TRPC6 activity. Even though Ser814 is within a consensus site for casein kinase II (CK2), we showed that CK2 is not involved in the phosphorylation of TRPC6 and does not modify its activity. In summary, we identified a new basal phosphorylation site (Ser814) on TRPC6 and showed that CK2 is not responsible for the phosphorylation of this site

Mécanisme d'action de l'angiotensine II sur les cellules glomérulées surrénaliennes bovines

L'angiotensine II (AII) est un régulateur important de la sécrétion d'aldostérone par les cellules de la zone glomérulée du cortex surrénalien. Récemment, des analogues non-peptidiques de l'AII ont permis de distinguer deux sous-types de récepteurs pour l'AII dans différents tissus. Avec une préparation membranaire de la zone glomérulée du cortex surrénalien bovin, nous avons effectué des courbes dose-déplacement de l’125I-AII par l'AII, le DuP 753 et le PD-123319. Les résultats ont démontré que les deux sous-types de récepteurs de l'AII (AT1 et AT2) étaient présents dans la zone glomérulée du cortex surrénalien bovin. Des analyses de Scatchard ont démontré que le sous-type AT1 possédait deux états d'affinité pour l'AII et que le sous-type AT2 possédait un seul état d'affinité pour l'AII. Nous avons réussi à inhiber la liaison de l’125-AII à une préparation membranaire de la zone glomérulée avec des concentrations croissantes de polyvinyl sulfate (PVS). Les résultats ont démontré que le PVS inhibe la liaison de l'AII, aux récepteur AT1. Des analyses de Scatchard ont démontré que le PVS inhibait la liaison de l'AII, en transférant le récepteur d'un état de haute affinité à un état de faible affinité. Les résultats ont démontré que le PVS interagissait directement avec un domaine intracellulaire du récepteur et provoquait un découplage du récepteur et de sa G-protéine. La dernière partie de cette thèse a porté sur la désensibilisation du récepteur AT1 de l'AII. La désensibilisation est un phénomène très bien connu pour les récepteurs des hormones qui stimulent l'adénylate cyclase, tels les récepteurs P-adrénergiques. Par contre, très peu d'études ont été effectuées sur la désensibilisation des récepteurs des hormones mobilisant le Ca2+, tel le récepteur AT, de l'AII. Nos résultats ont démontré qu'une préincubation des cellules glomérulées avec l'AII pouvait désensibiliser son récepteur. Cette désensibilisation s'est manifestée par une perte de liaison de l'AII lors d'une seconde incubation. Les résultats ont démontré que la désensibilisation du récepteur de l'AII n'était pas due à la perte dans le nombre maximal de sites de liaison mais plutôt au passage des récepteurs d'un état de haute affinité à un état de faible affinité. Nos résultats ont aussi démontré que la protéine kinase C ou la calmoduline kinase n'étaient pas impliquées dans la désensibilisation du récepteur de l'AII observée dans nos conditions expérimentales. Des études supplémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre les différents mécanismes impliqués dans la désensibilisation du récepteur AT1

Mécanisme d'action de l'angiotensine II sur les cellules glomérulées surrénaliennes bovines; implication de la phospholipase C : hypothèse du peptide complémentaire

La première partie de ce mémoire porte sur l'action stéroïdogénique de l'angiotensine II (AII). L'AII est un régulateur important de la sécrétion d'aldostérone par les cellules de la zone glomérulée du cortex surrénalien. Bien qu'il ait été suggéré que l'AII agisse via le métabolisme des lipides de l'inositol (cycle du PI), ces études se sont particulièrement concentrées sur les cinétiques d'apparition et sur l'identité des inositolphosphates. Le but de la présente étude est de vérifier la relation entre le métabolisme des lipides de l'inositol et la stéroïdogénèse. Une culture primaire de cellules de la zone glomérulée du cortex surrénalien de boeuf a été utilisée. Des courbes dose-réponse pour l'occupation du récepteur, la production d'inositolphosphates et la sécrétion d'aldostérone ont été faites dans les mêmes conditions expérimentales. La liaison du 125I-AII aux cellules de la zone glomérulée fut inhibée avec des doses croissantes d'AII. Les analyses de Scatchard ont montré un Kd de 1.3 ± 0.3 nM et une liaison maximale de 49000 ± 4500 récepteurs/ cellules (n=3). Les courbes dose-réponse pour la production d'inositol trisphosphate et d'inositol bisphosphate sont superposables. La dose-seuil est autour de 0.03 nM et l'effet maximal est obtenu avec 10 nM d'AII (EC50 = 0.5 ± 0.11 nM, n=5). La sécrétion d'aldostérone induite par l'AII s'est produite entre 0.8 nM (dose-seuil) et 3 nM (dose maximale) (EC50 = 0.42 ± 0.22 nM, n=5). Ces résultats suggèrent que la phospholipase C est impliquée dans l'action stéroïdogénique de l'AII. La deuxième partie de ce mémoire porte sur l'hypothèse du peptide complémentaire. Au cours des dernières années, une hypothèse fut développée selon laquelle des protéines qui interagissent spécifiquement (par exemple, une hormone peptidique et son récepteur) pourraient être codées par des acides nucléiques de séquences complémentaires. Ainsi un brin de ADN coderait pour l'hormone et son brin complémentaire coderait pour le récepteur. Afin de vérifier cette hypothèse avec l'AII, nous avons synthétisé l'octapeptide complémentaire, nommé IIA; Lys-Gly-Val-Asp-Val-Tyr-Ala-Val-COOH (dont la séquence est codée par le ADNc de l'angiotensinogène de rat). Dans notre culture primaire de cellules de la zone glomérulées, l'AII augmente la sécrétion d'une valeur basale de 40 pg/ 500000 cellules à une valeur maximale de 200 pg/ 500000 cellules avec une affinité d'environ 1 nM. L'effet stéroïdogénique de l'AII n'a pas été inhibé par des concentrations de peptide complémentaire IIA aussi fortes que 10 µM. De même, le peptide IIA n'a démontré aucun effet inhibiteur sur la liaison du 125I-AII à des membranes de cortex surrénalien. Ces résultats démontrent que le peptide IIA n'interagit pas avec l'AII. Nous concluons que l'hypothèse des peptides complémentaires n'est pas applicable dans le cas de l'AII

Mécanisme d'action de l'angiotensine II sur les cellules glomérulées surrénaliennes bovines

L'angiotensine II (AII) est un régulateur important de la sécrétion d'aldostérone par les cellules de la zone glomérulée du cortex surrénalien. Récemment, des analogues non-peptidiques de l'AII ont permis de distinguer deux sous-types de récepteurs pour l'AII dans différents tissus. Avec une préparation membranaire de la zone glomérulée du cortex surrénalien bovin, nous avons effectué des courbes dose-déplacement de l’125I-AII par l'AII, le DuP 753 et le PD-123319. Les résultats ont démontré que les deux sous-types de récepteurs de l'AII (AT1 et AT2) étaient présents dans la zone glomérulée du cortex surrénalien bovin. Des analyses de Scatchard ont démontré que le sous-type AT1 possédait deux états d'affinité pour l'AII et que le sous-type AT2 possédait un seul état d'affinité pour l'AII. Nous avons réussi à inhiber la liaison de l’125-AII à une préparation membranaire de la zone glomérulée avec des concentrations croissantes de polyvinyl sulfate (PVS). Les résultats ont démontré que le PVS inhibe la liaison de l'AII, aux récepteur AT1. Des analyses de Scatchard ont démontré que le PVS inhibait la liaison de l'AII, en transférant le récepteur d'un état de haute affinité à un état de faible affinité. Les résultats ont démontré que le PVS interagissait directement avec un domaine intracellulaire du récepteur et provoquait un découplage du récepteur et de sa G-protéine. La dernière partie de cette thèse a porté sur la désensibilisation du récepteur AT1 de l'AII. La désensibilisation est un phénomène très bien connu pour les récepteurs des hormones qui stimulent l'adénylate cyclase, tels les récepteurs P-adrénergiques. Par contre, très peu d'études ont été effectuées sur la désensibilisation des récepteurs des hormones mobilisant le Ca2+, tel le récepteur AT, de l'AII. Nos résultats ont démontré qu'une préincubation des cellules glomérulées avec l'AII pouvait désensibiliser son récepteur. Cette désensibilisation s'est manifestée par une perte de liaison de l'AII lors d'une seconde incubation. Les résultats ont démontré que la désensibilisation du récepteur de l'AII n'était pas due à la perte dans le nombre maximal de sites de liaison mais plutôt au passage des récepteurs d'un état de haute affinité à un état de faible affinité. Nos résultats ont aussi démontré que la protéine kinase C ou la calmoduline kinase n'étaient pas impliquées dans la désensibilisation du récepteur de l'AII observée dans nos conditions expérimentales. Des études supplémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre les différents mécanismes impliqués dans la désensibilisation du récepteur AT1

The S814A mutation does not alter TRPC6 activity.

<p><b>A</b>, [Ca²⁺]_i was recorded in HEK293T transiently transfected with pcDNA3 (open circles), TRPC6WT (open diamonds), or TRPC6^S814A (closed squares). The cells were incubated in the absence of extracellular Ca²⁺ (in the presence of 0.5 mM EGTA) for 30 s before being stimulated with 5 µM CCh. External Ca²⁺ (1.8 mM) was restored at 180 s. The graphs represent the average of 103 to 165 cells from one representative experiment. <b>B</b>, CCh-induced net Ca²⁺ entry (average of [Ca²⁺]_i values after 174–177 s subtracted from [Ca²⁺]_i values after 222–228 s) were calculated and graphed as averages ± SD of six independent experiments. * <i>P<0.01</i>.</p

CK2 does not phosphorylate TRPC6.

<p><b>A</b>, T6.11 cells were labeled in the presence or not of 10 µM DMAT or 10 µM TBCA for 4 h before the cells were lysed and TRPC6 was immunoprecipitated and separated by SDS-PAGE. The autoradiogram is representative of six independent experiments. <b>B</b>, The densitometric analyses of autoradiograms and Western blots (not shown) from <b>A</b> and the calculated ratios are relative to the control (100%). The histogram represents the average ± SD of six independent experiments.</p

MS/MS identification of potential phosphorylated residues on TRPC6.

<p><b>A</b>, Untreated T6.11 cells were lysed before TRPC6 was immunoprecipitated using an anti-HA antibody. The immunoprecipitated proteins were then deglycosylated with PNGaseF or not, before being separated by SDS-PAGE and stained with Colloidal Brilliant Blue. <b>B</b>, Sequence coverage of TRPC6 by nano-LC-MS/MS after tryptic digestion is highlighted. Ser⁸¹⁴ is shown in white on a black background. The transmembrane segments are underlined. Residues 931 to 939 represent the HA epitope. Total sequence coverage is 68%. <b>C</b>, Simplified LC-MS/MS spectrum of the FGISGpSHEDLSK peptide from TRPC6 phosphorylated at Ser⁸¹⁴. The phosphorylation of Ser⁸¹⁴ was confirmed by the mass assignments of fragmentation ions b5, b6, y6, and y7.</p