Evaluación toxicológica de cilindrospermopsina mediante modelos experimentales in vivo e in vitro: daños producidos por estrés oxidativo y potencial efectividad de n-acetilcisteína para contrarrestarlos

Texto completo descargado desde TeseoLas cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. La Cilindrospermopsina (CYN) es una de estas cianotoxinas, citotoxina que ha demostrado en roedores in vivo tener acción hepato y nefrotóxica, además de afectar a otros órganos, como pulmón, corazón, estómago, glándulas adrenales y sistemas vascular y linfoide. Además, se ha visto que es hepatotóxica e irritante en humanos. Se ha documentado que la CYN inhibe la síntesis de proteínas, interfiere la síntesis de glutatión reducido (GSH) y es genotóxica, aunque los estudios que se centran en ella aún son escasos. Debido a que la principal vía de entrada de CYN en el organismo es la oral, por ingestión de aguas y alimentos contaminados, consideramos de importancia el estudio de los efectos tóxicos de CYN sobre el tracto gastrointestinal (GI) y el tejido endotelial humano, ya que la CYN se absorbe a nivel GI y se distribuye por el resto del organismo a través de la sangre. Para ello, se emplearon como modelo experimental in vitro la línea celular intestinal humana Caco-2, modelo enterocítico in vitro más usado, establecido a partir de un carcinoma de colon humano, y la línea celular endotelial humana HUVEC, establecida a partir de endotelio vascular de cordón umbilical, las cuales imitan al sistema in vivo, permitiendo la medida de marcadores y actividades bioquímicas de interés. Los efectos tóxicos producidos por CYN en ambas líneas celulares fueron estudiados durante 24 y 48 horas de exposición para los ensayos de citotoxicidad basal y morfológicos, y durante 24 horas de exposición para los ensayos de estrés oxidativo, ya que no existen estudios sobre estas líneas celulares que traten la generación de estrés oxidativo por parte de la CYN. Los resultados de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células Caco-2 y HUVEC a los efectos tóxicos de la CYN está influenciada tanto por el tiempo de exposición, como por la concentración a la que se expusieron las células, siendo la línea celular HUVEC la más sensible de las dos. El bioindicador más sensible a la acción tóxica de la CYN en la línea Caco-2 fue la reducción de la sal de tetrazolio (MTS), mientras que en la línea celular HUVEC fue el ensayo de captación de rojo neutro (RN). En cuanto a los resultados de estrés oxidativo, se comprobó que ambas líneas celulares sufrían un incremento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) a la vez que un descenso en los niveles de GSH y de la actividad ¿-glutamilcisteina sintetasa (GCS), enzima limitante de la síntesis de GSH, a dosis de CYN bajas; a las dosis más elevadas, estos marcadores se veían incrementados y se reducía la cantidad de ERO. Las principales alteraciones morfológicas observadas en la línea celular Caco-2 fueron degeneración lipídica, daño mitocondrial y segregación nucleolar con núcleos alterados, mientras que en la línea celular HUVEC, se observaron principalmente segregación nucleolar con núcleos alterados, aumento del número de gránulos secretores, degeneración del aparato de Golgi y apoptosis Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: BIOCHEMICAL AND PATHOLOGICAL TOXIC EFFECTS INDUCED BY PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE HUMAN CELL LINE CACO-2 (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Water Research, en revisión) ALTERATIONS OBSERVED IN ENDOTHELIAL HUVEC CELL LINE EXPOSED TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Archives of Toxicology) Siguiendo con los estudios in vitro y comprobados los efectos tóxicos de la CYN sobre las líneas celulares humanas, quisimos investigar el efecto que podría tener sobre la línea celular hepática del ciprínido Poeciliopsis lucida, PLHC-1, ya que, hasta la fecha, los estudios sobre la toxicidad de la CYN en modelos piscícolas tanto in vitro como in vivo son muy escasos, a pesar de su posible exposición al compartir hábitat. Para tratar esta cuestión, se realizaron nuevamente ensayos de citotoxicidad basal (24 y 48 horas) y de estrés oxidativo (24 horas). Los ensayos de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células PLHC-1 a los efectos tóxicos de la CYN era dependiente tanto de la concentración como del tiempo de exposición, siendo el bioindicador más sensible el contenido proteico total (PT). Se comprobó que la línea celular PLHC-1 era la menos sensible de las tres líneas celulares ensayadas. Con respecto a los ensayos de estrés oxidativo, se observó un aumento de la producción de ERO así como un descenso en los niveles de GSH y de la actividad de la enzima GCS. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: TOXICITY AND GLUTATHIONE IMPLICATION IN THE EFFECTS OBSERVED BY EXPOSURE OF THE LIVER FISH CELL LINE PLHC-1 TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 1567-72) La CYN es una cianotoxina que se encuentra, en gran parte, de forma libre disuelta en el medio, por lo que un gran número de organismos acuáticos (fitoplancton, zooplancton, plantas y animales) pueden entrar en contacto con ella. Por ello, y una vez conocidos los efectos tóxicos que produce en los modelos celulares in vitro, consideramos de gran importancia investigar los efectos y repercusiones de dicha toxina in vivo sobre tilapias (Oreochromis niloticus), ya que es una especie de pez que crece en aguas susceptibles de contaminación por CYN, y además cada vez está cobrando mayor importancia como fuente de alimento para humanos. Nuestro estudio se centró en investigar la inducción de estrés oxidativo como mecanismo de toxicidad asociada a CYN en función de la vía de exposición y el tiempo de sacrificio, así como los posibles daños histopatológicos que podía ocasionar. Para este fin, se intoxicaron tilapias con una dosis única de 200 ¿g CYN pura/kg p.c. (seleccionada en base a estudios previos) por vía oral, mediante sonda gástrica (gavage) y por vía intraperitoneal (i.p.). Tras 24 horas y 5 días, los peces fueron sacrificados y se analizaron diferentes actividades enzimáticas, nivel de peroxidación lipídica (LPO), oxidación de proteínas y ADN, y contenido de GSH. De esta forma, comprobamos que la CYN producía un incremento de la actividad NADPH oxidasa, de los niveles de LPO y de la oxidación de proteínas, no producía oxidación del ADN en las condiciones ensayadas, y disminuía el contenido de GSH y la actividad GCS, lo que indica la importancia de estas enzimas en la patogenicidad de la CYN. Además, se comprobó que el tiempo de sacrificio influía más en los resultados que la vía de administración de la toxina, ya que los peces sacrificados a los 5 días tras la exposición presentaban la recuperación de algunos de los biomarcadores estudiados, mientras que otros parámetros mostraban mayor afectación. Al mismo tiempo, nos planteamos el estudio de las variaciones en la expresión génica de las enzimas Glutatión peroxidasa (GPx) y Glutatión-S-transferasa (GST), así como la abundancia relativa de GST en hígado y riñón bajo las mismas condiciones. El objetivo principal fue evaluar la alteración de los niveles de ARNm y la abundancia de proteínas de estas enzimas, ya que estos marcadores pueden proporcionar una información temprana sobre el estado del pez. Los resultados mostraron que estos parámetros se veían más afectados por la vía i.p. y en peces sacrificados tras 5 días. Por último, también se estudiaron los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos (hígado, riñón, intestino, corazón y branquias), comprobándose que no se producía una recuperación de las lesiones histopatológicas inducidas a los 5 días de la exposición a la toxina, lo cual demuestra la toxicidad retardada de CYN en este modelo experimental. Los resultados de este experimento dieron lugar a las siguientes publicaciones: OXIDATIVE STRESS RESPONSES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN UNDER LABORATORY CONDITIONS: INFLUENCE OF EXPOSURE ROUTE AND TIME OF SACRIFICE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aquatic Toxicology 105, 100-6) INFLUENCE OF THE EXPOSURE WAY AND THE TIME OF SACRIFICE ON THE EFFECTS INDUCED BY A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE ACTIVITY AND TRANSCRIPTION OF GLUTATHIONE PEROXIDISE AND GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE ENZYMES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Toxicon) TIME-DEPENDENT HISTOPATHOLOGICAL CHANGES INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) AFTER ACUTE EXPOSURE TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN BY ORAL AND INTRAPERITONEAL ROUTE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aceptado en Ecotoxicology and Environmental Safety) Tras confirmar la producción de estrés oxidativo como mecanismo de acción tóxica de la CYN tanto in vitro como in vivo, quisimos investigar el efecto protector de la N-acetilcisteína (NAC), precursor del GSH, frente al daño oxidativo e histopatológico que pueden inducir tanto la CYN pura como liofilizados de cianobacterias productoras de CYN (+CYN) en tilapias. Los peces fueron pretratados con 0, 22 y 45 mg NAC/pez/día durante una semana, tras la cual fueron expuestos a una dosis única de, o bien 200 ¿g/kg pc de CYN pura o bien 200 ¿g/kg pc de CYN procedente de un liofilizado de Aphanizomenon ovalisporum, mezcladas con el alimento, y se sacrificaron a las 24 horas. Al igual que en el experimento anterior, se analizaron diferentes actividades enzimáticas, niveles de LPO, oxidación de proteínas, contenido de GSH, expresión génica de las enzimas GPx y GST y los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos. Los resultados mostraron un papel protector de la NAC en función de la dosis y el marcador biológico analizado. Así, sobre las actividades enzimáticas mejoraba la situación de estrés inducida por la CYN, tanto en el caso de la toxina pura como en el liofilizado de las células productoras de CYN (+CYN). Con respecto a la LPO se observa una recuperación de los valores basales y en cuanto al contenido de GSH se recuperaban los niveles tras la depleción sufrida en los grupos intoxicados con CYN sin pretratamiento. Además, estudiamos las repercusiones que la NAC podía ocasionar sobre el hígado, riñón, intestino, corazón y branquias a nivel histopatológico. Los resultados mostraron como la CYN procedente del liofilizado de A. ovalisporum producía daños más severos en los diferentes órganos en comparación con la CYN pura. Además, también se comprobó que la NAC ejercía un efecto protector frente a la CYN, reduciendo los daños observados. Por tanto, puede considerarse la NAC como un agente quimioprotector útil en la prevención de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a una solicitud de patente, y a la siguiente publicación: PROTECTIVE ROLE OF DIERTARY N-ACETYLCYSTEINE ON THE OXIDATIVE STRESS INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Aquatic Toxicology) Por último, consideramos fundamental el inicio de las investigaciones para conocer el impacto de la CYN sobre plantas de consumo humano, ya que tras revisar la bibliografía científica, se constata la ausencia casi total de información disponible. Para ello, se comenzó con un análisis previo enfocado desde un punto de vista molecular para, de esta forma, poder identificar genes/proteínas implicados en el proceso de producción de toxicidad. Quisimos caracterizar la expresión proteica de la planta de tomate (Solanum lycopersicum) expuesta a CYN pura y extractos de CYN procedentes de cultivos de A. ovalisporum. Se emplearon geles de dos dimensiones (2DE) para el análisis proteómico de hojas de tomate. Además, se comprobó que la toxina puede ser el principal factor responsable del estrés fisiológico observado en las plantas, aunque existen otras moléculas bioactivas sintetizadas por las células de A. ovalisporum que podrían contribuir a la toxicidad observada. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: ALTERATIONS ON PROTEIN EXPRESSION INDUCED BY CYLINDROSPERMOPSIN IN TOMATO PLANTS (SOLANUM LYCOPERSICUM) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Pendiente de envío) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la validez de las técnicas in vitro e in vivo empleadas para la evaluación toxicológica de la CYN, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica con respecto a esta cianotoxina.Premio Extraordinario de Doctorado U

In vitro study of the viability of Caco-2 cells in presence of two compound of Allium spp essential oil

El aceite esencial de los componentes del género Allium, principalmente ajo y cebolla, presenta propiedades antioxidantes y antibacterianas debidas a la presencia de compuestos azufrados en su composición. La industria alimentaria ha comenzado a desarrollar nuevos sistemas de envasado activo a partir de polímeros seleccionados, a los que se incorporan aceites esenciales que, por sus propiedades, contribuyen a aumentar la vida útil de los alimentos perecederos. En este sentido, se hace necesario evaluar la seguridad asociada al uso de estas sustancias en envases alimentarios que van a estar en contacto con el consumidor a través del alimento. El objetivo del presente estudio fue determinar la citotoxicidad producida por dipropil sulfuro y dipropil disulfuro, dos de los componentes del aceite esencial de ajo y cebolla, en la línea celular Caco-2, células humanas procedentes de carcinoma de colon. Los biomarcadores ensayados fueron el contenido total de proteínas, la captación de rojo neutro y la reducción de la sal de tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4sulfofenil)-2H-tetrazolio). Las células fueron expuestas durante 2, 4 y 8 h a concentraciones comprendidas entre 0 y 200 μM. Los resultados no mostraron diferencias significativas frente al control para ninguno de los tres marcadores, lo que demuestra que bajo las condiciones de los ensayos ambos compuestos azufrados no son citotóxicos para esta línea celular gastrointestinal y podrían ser útiles en la industria alimentaria para desarrollar envases activos.Allium spp. essential oil, mainly from garlic and onion, possesses different beneficial properties, for example antioxidant and antimicrobial effects, due to the presence of sulfur compounds. Food industry is developing new active packaging systems that include the essential oil of garlic in their structure, in order to improve the shelf-life of perishable products. Therefore it is necessary to evaluate the safety associated with the use of these substances in food packaging that will be in contact with the consumer through food. The aim of our study was to evaluate in vitro the cytotoxicity of dipropyl sulfide and dipropyl disulfide. For this purpose, we used the human Caco-2 cell line, from human small intestinal mucosa carcinoma. The assayed cytotoxicity biomarkers were the total protein content, neutral red uptake and reduction of the 3-( 4, 5 - dimethylthiazol - 2 - y l ) - 5 - ( 3 - carboximethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt. Cells were exposed to dipropyl sulfide and dipropyl disulfide in concentrations between 0-200 μM for 2, 4 and 8 h. After periods of exposure, no alterations were observed in any of the biomarkers assayed. These results suggest that both organosulfur compounds are safety options for food industry and could be a choice in the development of active packaging.Ministerio de Ciencia e Innovación (España) AGL2012-38357-C02-01Junta de Andalucía AGR-7252Servicio de Biología del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS

Student mentoring program at the Faculty of Pharmacy, University of Seville (2006/07 - present): SWOT analysis carried out by mentor students

El “Programa de Alumnos Tutores” (LCC, Facultad de Farmacia US) se viene realizando ininterrumpidamente desde 2006/07 hasta la actualidad. Propósito: tutela de alumnos de nuevo ingreso por parte de alumnos de cursos superiores (AATT) bajo la supervisión de Profesores Tutores. Pretende generar una actitud responsable en los AATT y favorecerles el desarrollo de habilidades sociales. El objetivo de este trabajo es recoger las opiniones de los AATT (algunos comenzaron en ediciones anteriores y continúan desinteresadamente). Se aborda mediante un análisis DAFO. Conclusión: se han detectado factores estratégicos críticos, para una vez identificados, usarlos y apoyar en ellos la marcha del “Programa de Alumnos Tutores”, consolidando las fortalezas, minimizando las debilidades, aprovechando las ventajas de las oportunidades, y eliminando o reduciendo las amenazas.The "Student Mentor Program" (Faculty of Pharmacy, US) has been running since 2006/07 – to present. Purpose: to mentor new students by senior students (Mentor Students) under the supervision of mentor professors. It aims to generate a responsible attitude in students and tutors to encourage the development of social skills. Objective: To collect the views of mentor students (some started in previous years and continue to selflessly), through a SWOT analysis. Conclusion: it has been found critical strategic factors. It intends to use these factors for strengthening the "Student Mentor Program"

Mutagenic and genotoxic potential of pure Cylindrospermopsin by a battery of in vitro tests

Cylindrospermopsin (CYN) is a cyanobacterial toxin with an increasing world-wide occurrence. The main route of human exposure is through the ingestion of contaminated food and water. The European Food Safety Authority has identified the need to further characterize the toxicological profile of cyanotoxins and in this regard the genotoxicity is a key toxicological effect. The data available in the scientific literature show contradictory results. Thus, the aim of this study was to investigate the mutagenic and genotoxic effects of pure CYN using a battery of different in vitro assays including: the bacterial reverse-mutation assay in Salmonella typhimurium (Ames test) (0–10 μg/mL), the mammalian cell micronucleus (MN) test (0–1.35 μg/mL and 0–2 μg/mL in absence or presence of S9 fraction, respectively) and the mouse lymphoma thymidine-kinase assay (MLA)(0–0.675 μg/mL) on L5178YTk ± cells, and the standard and enzyme-modified comet assays (0–2.5 μg/mL) on Caco-2 cells. Positive results were obtained only when the metabolic fraction S9 was employed in the MN test, suggesting pro-genotoxic properties of CYN. Also, DNA damage was not mediated by oxidative stress as CYN did not induced changes in the modified comet assay. These data could contribute to a better risk assessment of this cyanotoxin.Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2015-64558-R, MINECO/FEDER, U

Neurotoxicity induced by microcystins and cylindrospermopsin: A review

Microcystins (MCs) and cylindrospermopsin (CYN) are among the most frequent toxins produced by cyanobacteria. These toxic secondary metabolites are classified as hepatotoxins and cytotoxin, respectively. Furthermore, both may present the ability to induce damage to the nervous system. In this sense, there are many studies manifesting the potential of MCs to cause neurotoxicity both in vitro and in vivo, due to their probable capacity to cross the blood-brain-barrier through organic anion transporting polypeptides. Moreover, the presence of MCs has been detected in brain of several experimental models. Among the neurological effects, histopathological brain changes, deregulation of biochemical parameters in brain (production of oxidative stress and inhibition of protein phosphatases) and behavioral alterations have been described. It is noteworthy that minority variants such as MC-LF and -LW have demonstrated to exert higher neurotoxic effects compared to the most studied congener, MC-LR. By contrast, the available studies concerning CYN-neurotoxic effects are very scarce, mostly showing inflammation and apoptosis in neural murine cell lines, oxidative stress, and alteration of the acetylcholinesterase activity in vivo. However, more studies are required in order to clarify the neurotoxic potential of both toxins, as well as their possible contribution to neurodegenerative diseases.Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2015-64558-R, MINECO/FEDER, UE

Neurotoxic assessment of Microcystin-LR, cylindrospermopsin andtheir combination on the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line

Microcystin-LR (MC-LR) and Cylindrospermopsin (CYN) are produced by cyanobacteria. Although being considered as a hepatotoxin and a cytotoxin, respectively, different studies have revealed neurotoxic properties for both of them. The aim of the present work was to study their cytotoxic effects, alone and in combination, in the SH-SY5Y cell line. In addition, toxicity mechanisms such as oxidative stress and acetylcholinesterase (AChE) activity, and morphological studies were carried out. Results showed a cytotoxic response of the cells after their exposure to 0–100 μg/mL of MC-LR or 0–10 μg/mL CYN in both differentiated and undifferentiated cells. Thus, CYN resulted to be more toxic than MC-LR. Respect to their combination, a higher cytotoxic effect than the toxins alone in the case of undifferentiated cells, and almost a similar response to the presented by MC-LR in differentiated cells were observed. However, after analyzing this data with the isobolograms method, an antagonistic effect was mainly obtained. The oxidative stress study only showed an affectation of glutathione levels at the highest concentrations assayed of MC-LR and the combination in the undifferentiated cells. A significant increase in the AChE activity was observed after exposure to MC-LR in undifferentiated cells, and after exposure to the combination of both cyanotoxins on differentiated cells. However, CYN decreased the AChE activity only on differentiated cultures. Finally, the morphological study revealed different signs of cellular affectation, with apoptotic processes at all the concentrations assayed. Therefore, both cyanotoxins isolated and in combination, have demonstrated to cause neurotoxic effects in the SH-SY5Y cell line.Ministerio de Economía y Com-petitividad of Spain (AGL2015-64558-R, MINECO/FEDER, UE)Junta de Andalucia for the contact of María Gracia Hinojosa (USE-16667

Estudio de la citotoxicidad basal de compuestos antioxidantes presentes en el aceite esencial de orégano: CARVACROL y TIMOL

Ministerio de Ciencia e Innovación AGL2012-38357-C02-01Junta de Andalucía AGR-725