Caractérisation moléculaire des signaux de sécrétion des protéines sécrétées par le système de sécrétion de type II de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii

The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SSLe système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2S

Molecular characterization of secretion signals of proteins secreted by the type II secretion system of the phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SSThe type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2S

Des stylet(s) à leur cuticule: transcriptomique et genomique des proteines cuticulaires de puceron

International audienceLes stylets de pucerons sont un exemple de pièces buccales très spécialisées que l’ont trouve chez lesHemiptères. Leur conception a débuté il y a plus de 250 millions d’années. Ils ont des caractéristiques spécifiques, partagées ou non avec d’autres familles d'hémiptères.Au cours d’un projet de biologie vectorielle, nous avons identifié l’ensemble complet de protéines cuticulaires des stylets maxillaires et mandibulaires du puceron modèle, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Une extension de la définition des protéines cuticulaires est proposée, étendant de près de 80% les classes actuelles de protéines cuticulaires. Cette définition se base sur les biais compositionnels et non sur des homologies de séquences. Nous passerons en revue les résultats obtenus dans ce contexte, ainsi que l’ouverture d’un volet sur la génomique comparative des protéines cuticulaires au sein des hémiptères, et potentiellement au-delà

Vection des bactéries par les insectes : la cuticule importe t’elle ?

Vection des bactéries par les insectes : la cuticule importe t’elle ?. 10. Réunion annuelle du Réseau de Biologie Adaptative des Pucerons et Organismes Associés : Bapo

Biomimétisme: quand l’humain s’inspire de la nature. Acte III: Matériaux bio-inspirés: céramiques fonctionnelles, et polymères inspirés de la cuticule

Cycle de 4 conférences sur le biomimétisme organisé par Viencent Montbel & Julien Castellani (Biosciences, INSA-Lyon

From stylet to cuticle: Transcriptomics and genomics of aphid cuticular protein

International audienc

Analysis of the retort organs, producing mouthpart cuticle, in (the pea) aphid

International audienceLes pucerons transmettent la plupart des virus végétaux, et pour une bonne partie de ces derniers (les virus non-circulants), les stylets de l’insecte sont les pièces anatomiques effectives de cette vection. Depuis uen dizaine d’année, la découverte d’un micro-organe spécifique à cette fonction, l’acrostyle, intéresse particulièrement les chercheusr en mécanismes moléculaires de la vection. En effet, comme cela a été prouvé dasn les deux dernières années, cet acrostyle porte les déterminants moléculaires (récepteurs) de la transmission par puceron de plusieusr de ces phytovirus, le CaMV notamment.Dans le cadre du projet ANR StylHook, un module de travail (WP1) a porté sur la caractérisation exhaustive des proteins de l’acrostyle et des stylets du puceron du pois, dont le génome est identifié et correctement annoté depuis 2010. Ce travail analytique sur les protéines cuticulaires (structurales) des pucerons a été lancé par une approche quadruple:1: Caractérisation (immuno-)histologique et cellulaire de l’organe responsable de la synthèse périodique des stylets lors de la mue de l’insecte (la glande cuticulaire appelée « retort  organ », ou « organe alambiqué »…2: Caractérisation protéomique des stylets, et tentative de caractérisation de l’acrostyle par la même approche et microdissection laser3: Caréctrisation protéomique des glandes des stylets (retort organ, glandes maxillaires et mandibulaires)4: Caractérisation transcriptomique de l’organ retort au momùent du pic de transcription pre-ecdysial (pic de synthèse des stylets adultes).Ces résultats ont permis une caractérisation très exhaustive (couverture totale) de la composition cuticulaire protéique des stylets, une identification des quelques différences (protéomique, pas transcriptomique) entre stylets maxillaires et mandibulaires.Ils nous ont permis de montrer que ce matériau était pour l’heure le plus complexe des matériaux cuticulaires analysés jusqu’à présent (cuticule larvaire de lépidoptères, ailes de coléoptères ou de diptères), et nosu ont permis de proposer une méthode non-homologique pour la prédiction de nouvelles classes de protéines cuticulaires chez les insectes, basées sur le biais compositionnel et non sur les algorithmes d’identification/classification basés sur des régions conservées (HMM) classiqument utilisé jusque-là

Insect mouthpart transcriptome unveils extension of cuticular protein repertoire and complex organization

International audienceSummary Insects have developed intriguing cuticles with very specific structures and functions, including microstructures governing their interactions with transmitted microbes, such in aphid mouthparts harboring virus receptors within such microstructures. Here, we provide the first transcriptome analysis of an insect mouthpart cuticle (“retort organs” ROs, the stylets’ precursors). This analysis defined stylets as a complex composite material. The retort transcriptome also allowed us to propose an algorithmic definition of a new cuticular protein (CP) family with low complexity and biased amino-acid composition. Finally, we identified a differentially expressed gene encoding a pyrokinin (PK) neuropeptide precursor and characterized the mandibular glands. Injection of three predicted synthetic peptides PK1/2/3 into aphids prior to ecdysis caused a molt-specific phenotype with altered head formation. Our study provides the most complete description to date of the potential protein composition of aphid stylets, which should improve the understanding of the transmission of stylet-borne viruses