Étude de variants du gène de la calséquestrine de type 2 (CASQ2)

La calséquestrine de type 2 (Casq2) est la protéine majeure de chélation du calcium dans le reticulum sarcoplasmique dans le muscle cardiaque. Elle est impliquée dans une sévère pathologie rythmique héréditaire : la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique. Les mutations de CASQ2 identifiées à Grenoble au laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire de 2007 à 2013 ont été recensées et l impact sur l épissage des mutations introniques et faux-sens a été évalué en utilisant des logiciels de prédiction. Deux mutations de CASQ2 ont fait l objet d une étude fonctionnelle: c.44C>G ; p.S15C localisée dans le peptide signal, et c.838+88T>G, une mutation intronique pouvant affecter l épissage. Les prédictions in silico n ont pas mis en évidence d altération de l épissage pour les variations faux-sens testées mais il apparaît que la moitié des mutations identifiées au laboratoire ont un impact sur l épissage. L utilisation d un minigène sauvage et muté en 838+88T>G a permis l étude des transcrits in vitro et n a montré aucun impact sur l épissage. La mutation p.S15C a été étudiée in vitro par expression ectopique. Cette mutation ne semble pas affecter la localisation de Casq2 dans le reticulum. En revanche, l étude de polymérisation suggérait un défaut de dimérisation de la protéine mutée, bien que ce résultat soit à confirmer. En conclusion, ces résultats n ont pas pu prouver la pathogénicité des mutations p.S15C et 838+88T>G mais ont permis de valider de nouveaux outils pour l étude fonctionnelle des variations qui seront identifiées au laboratoire.Cardiac calsequestrin (Casq2) is the major calcium storage protein in the sarcoplasmic reticulum of cardiomyocytes. It is involved in catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, a severe inherited arrythmogenic disorder. CASQ2 mutations identified from 2007 to 2013 in the Molecular Genetic Laboratory of Grenoble were gathered and splicing effects of intronic and missense mutations were evaluated with prediction softwares. Functionnal analysis of two CASQ2 mutations was performed: p.S15C, a missense mutation in the signal peptide, and c.838+88T>G, a deep intronic mutation possibly involved in splicing defect. In silico predictions did not detect any splicing effect for the missense mutations but half of the mutations identified in the laboratory were shown to affect CASQ2 splicing. Wild-type and mutant c.838+88T>G minigene in vitro analysis showed no splicing defect. Wild-type and p.S15C mutant were analyzed after cell line transfections. Immunofluorescence studies, immunoblots, and glycosylation studies showed no effect of the p.S15C mutation. Polymerization studies suggested a dimerization defect for the mutant protein, although this results needs to be confirmed. In conclusion, these results could not prove the pathogenicity of the p.S15C and c.838+88T>G mutations but allowed the validation of new tools for further functional analysis in the laboratory.GRENOBLE1-BU Médecine pharm. (385162101) / SudocSudocFranceF

Erratum: The genomic architecture of NLRP7 is Alu rich and predisposes to disease-associated large deletions

NLRP7 is a major gene responsible for recurrent hydatidiform moles. Here, we report 11 novel NLRP7 protein truncating variants, of which five deletions of more than 1-kb. We analyzed the transcriptional consequences of four variants. We demonstrate that one large homozygous deletion removes NLRP7 transcription start site and results in the complete absence of its transcripts in a patient in good health besides her reproductive problem. This observation strengthens existing data on the requirement of NLRP7 only for female reproduction. We show that two other variants affecting the splice acceptor of exon 6 lead to its in-frame skipping while another variant affecting the splice donor site of exon 9 leads to an in-frame insertion of 54 amino acids. Our characterization of the deletion breakpoints demonstrated that most of the breakpoints occurred within Alu repeats and the deletions were most likely mediated by microhomology events. Our data define a hotspot of Alu instability and deletions in intron 5 with six different breakpoints and rearrangements. Analysis of NLRP7 genomic sequences for repetitive elements demonstrated that Alu repeats represent 48% of its intronic sequences and these repeats seem to have been inserted into the common NLRP2/7 primate ancestor before its duplication into two genes

Identification and characterization of genes responsible of autoinflammatory diseases

Les maladies auto-inflammatoires monogéniques sont des pathologies mendéliennes causées par des mutations de gènes impliqués dans l’immunité innée. Elles se traduisent chez les patients par des poussées inflammatoires systémiques, des atteintes tissulaires, sans production d’auto-anticorps. La première partie de la thèse est une étude comparative entre le séquençage Sanger et le séquençage nouvelle génération (NGS). Les 297 patients étaient inclus prospectivement et randomisés en 2 bras : Sanger et NGS. Nous avons conclu que l’approche NGS doublait le rendement diagnostique (10.1%) par rapport au Sanger (4.1%). Nous avons également montré que les 4 fièvres récurrentes héréditaire historiques n’étaient pas les plus fréquentes dans notre série. La deuxième étude rapporte la première duplication entière du gène MEFV chez une patiente atteinte de FMF. Nous avons montré qu’il s’agit d’une duplication en tandem et avons pu séquencer le point de cassure. L’implication de la duplication dans l’apparition de la maladie n’est pas claire et des études d’expression seraient nécessaires pour pouvoir conclure. Le troisième volet traite du phénomène de mosaïcisme dans les MAI, notamment les CAPS, par une revue de la littérature, enrichie par de nouveaux cas identifiés à Montpellier. Nous n’avons pas mis en évidence d’impact du taux de mosaïcisme sur les manifestations cliniques ou sur l’âge de début des symptômes. La quatrième étude rapporte une série de cas de patients atteint de déficit en adénosine déaminase de type 2, nous permettant d’enrichir le spectre des mutations connues. Nous avons également proposé un arbre décisionnel afin de proposer un diagnostic génétique plus rapide. Enfin, la cinquième étude est l’identification d’un nouveau gène responsable de syndrome auto-inflammatoire associé au protéasome (PRAAS) chez une patiente consanguine. Nous avons montré l’implication du gène PSMB10 dans la physiopathologie de la patiente, en conduisant des études in vitro et ex vivo. Les résultats in vitro montraient, dans une lignée cellulaire transfectée, une altération des fonctions enzymatiques du protéasome et une anomalie du clivage normal de la protéine, empêchant probablement l’assemblage correct de l’immunoprotéasome. Les études ex vivo sur cellules nucléées de la patiente montraient également des anomalies enzymatiques, ainsi qu’une accumulation de protéine ubiquitinylées, témoignant d’un dysfonctionnement de l’immunoprotéasome.Monogenic systemic autoinflammatory diseases (SAIDs) are Mendelian pathologies caused by gene mutations involved in innate immunity. Autoinflammatory patients exhibit inflammatory flares, tissue damage, without production of autoantibodies. The first part of the thesis is a comparative study between Sanger sequencing and Next Generation Sequencing (NGS). The 297 patients were included prospectively and randomized into 2 arms: Sanger and NGS. We concluded that the NGS approach doubled the diagnostic yield (10.1%) compared to the Sanger (4.1%). We also showed that the 4 historical hereditary recurrent fevers were not the most frequent in our series. The second study reports the first duplication of the MEFV gene in a FMF patient. We have shown that this is a tandem duplication and have been able to sequence the breakpoint. The implication of this duplication in the onset of the disease is unclear and studies of expression would be necessary. The third part deals with the phenomenon of mosaicism in SAIDs (cryopyrin associated periodic syndrom (CAPS) in particular)), by a literature review, enriched by new cases identified in Montpellier. We did not show any impact of the mosaicism rate on clinical manifestations or age of onset of symptoms.The fourth study reports a series of cases of patients with type 2 adenosine deaminase deficiency, allowing us to expand the mutation spectrum. We also proposed a decision tree to fasten the genetic diagnosis. Finally, the fifth study is the identification of a new gene responsible for proteasome-associated autoinflammatory syndrome (PRAAS) in a consanguineous patient. We have shown the involvement of the PSMB10 gene in the pathophysiology of the patient, conducting in vitro and ex vivo studies. The in vitro results showed, in a transfected cell line, an alteration of the enzyme functions of the immunoproteasome, and defects of the normal cleavage of the protein, probably preventing the correct assembly of the immunoproteasome. The ex vivo cell studies of the patient also showed enzymatic abnormalities, as well as ubiquitinylated protein accumulation, indicating immunoproteasome dysfunction

Identification et caractérisation de gènes impliqués dans les maladies auto-inflammatoires

Monogenic systemic autoinflammatory diseases (SAIDs) are Mendelian pathologies caused by gene mutations involved in innate immunity. Autoinflammatory patients exhibit inflammatory flares, tissue damage, without production of autoantibodies. The first part of the thesis is a comparative study between Sanger sequencing and Next Generation Sequencing (NGS). The 297 patients were included prospectively and randomized into 2 arms: Sanger and NGS. We concluded that the NGS approach doubled the diagnostic yield (10.1%) compared to the Sanger (4.1%). We also showed that the 4 historical hereditary recurrent fevers were not the most frequent in our series. The second study reports the first duplication of the MEFV gene in a FMF patient. We have shown that this is a tandem duplication and have been able to sequence the breakpoint. The implication of this duplication in the onset of the disease is unclear and studies of expression would be necessary. The third part deals with the phenomenon of mosaicism in SAIDs (cryopyrin associated periodic syndrom (CAPS) in particular)), by a literature review, enriched by new cases identified in Montpellier. We did not show any impact of the mosaicism rate on clinical manifestations or age of onset of symptoms.The fourth study reports a series of cases of patients with type 2 adenosine deaminase deficiency, allowing us to expand the mutation spectrum. We also proposed a decision tree to fasten the genetic diagnosis. Finally, the fifth study is the identification of a new gene responsible for proteasome-associated autoinflammatory syndrome (PRAAS) in a consanguineous patient. We have shown the involvement of the PSMB10 gene in the pathophysiology of the patient, conducting in vitro and ex vivo studies. The in vitro results showed, in a transfected cell line, an alteration of the enzyme functions of the immunoproteasome, and defects of the normal cleavage of the protein, probably preventing the correct assembly of the immunoproteasome. The ex vivo cell studies of the patient also showed enzymatic abnormalities, as well as ubiquitinylated protein accumulation, indicating immunoproteasome dysfunction.Les maladies auto-inflammatoires monogéniques sont des pathologies mendéliennes causées par des mutations de gènes impliqués dans l’immunité innée. Elles se traduisent chez les patients par des poussées inflammatoires systémiques, des atteintes tissulaires, sans production d’auto-anticorps. La première partie de la thèse est une étude comparative entre le séquençage Sanger et le séquençage nouvelle génération (NGS). Les 297 patients étaient inclus prospectivement et randomisés en 2 bras : Sanger et NGS. Nous avons conclu que l’approche NGS doublait le rendement diagnostique (10.1%) par rapport au Sanger (4.1%). Nous avons également montré que les 4 fièvres récurrentes héréditaire historiques n’étaient pas les plus fréquentes dans notre série. La deuxième étude rapporte la première duplication entière du gène MEFV chez une patiente atteinte de FMF. Nous avons montré qu’il s’agit d’une duplication en tandem et avons pu séquencer le point de cassure. L’implication de la duplication dans l’apparition de la maladie n’est pas claire et des études d’expression seraient nécessaires pour pouvoir conclure. Le troisième volet traite du phénomène de mosaïcisme dans les MAI, notamment les CAPS, par une revue de la littérature, enrichie par de nouveaux cas identifiés à Montpellier. Nous n’avons pas mis en évidence d’impact du taux de mosaïcisme sur les manifestations cliniques ou sur l’âge de début des symptômes. La quatrième étude rapporte une série de cas de patients atteint de déficit en adénosine déaminase de type 2, nous permettant d’enrichir le spectre des mutations connues. Nous avons également proposé un arbre décisionnel afin de proposer un diagnostic génétique plus rapide. Enfin, la cinquième étude est l’identification d’un nouveau gène responsable de syndrome auto-inflammatoire associé au protéasome (PRAAS) chez une patiente consanguine. Nous avons montré l’implication du gène PSMB10 dans la physiopathologie de la patiente, en conduisant des études in vitro et ex vivo. Les résultats in vitro montraient, dans une lignée cellulaire transfectée, une altération des fonctions enzymatiques du protéasome et une anomalie du clivage normal de la protéine, empêchant probablement l’assemblage correct de l’immunoprotéasome. Les études ex vivo sur cellules nucléées de la patiente montraient également des anomalies enzymatiques, ainsi qu’une accumulation de protéine ubiquitinylées, témoignant d’un dysfonctionnement de l’immunoprotéasome

Dominant familial Mediterranean fever

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Management of hereditary recurrent fevers—SHARE experience

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Diagnosis of cryopyrin-associated periodic syndrome: challenges, recommendations and emerging concepts

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The autoinflammatory diseases: a fashion with blurred boundaries!

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Phenotypic Associations of PSTPIP1 Sequence Variants in PSTPIP1-Associated Autoinflammatory Diseases

International audiencePathogenic variants in the PSTPIP1 gene cause pyogenic sterile arthritis, pyoderma gangrenosum, and acne (PAPA) syndrome. They were also identified in a broad spectrum of phenotypes. As their interpretation is sometimes challenging, we discuss the genotype-phenotype association in PSTPIP1-associated autoinflammatory diseases (PAIDs) in light of a recent consensus classification of variant pathogenicity. Only 7 of 39 (18%) of the PSTPIP1 variants found in all reported cases and our national reference center (161 patients [114 probands]) were pathogenic. They were clearly associated with PAPA and PSTPIP1-associated myeloid-related proteinemia inflammatory syndrome (PAMI), reflecting a variable clinical expression of PAIDs