Μελέτη βιοϋμενίων από μικροοργανισμούς που σχετίζονται με τη ζύμωση της επιτραπέζιας ελιάς

Fermentation is one of the oldest and most widespread methods for food preservation that appeared with the dawn of civilization. Table olives are among the post popular agricultural products of the Western world that are consumed as fermented. The fermentation process aims at the complete or partial removal of the phenolic compound oleuropein, which makes olive drupes too bitter for direct consumption upon harvest, and the development of a final product with enhanced sensory and preservation characteristics. Table olive fermentation has been attributed to the selective action of microorganisms originating from the olive’s microbiota, mainly lactic acid bacteria (LAB) and yeasts. Until recently, the population dynamics of the microbial groups driving the fermentation process, mainly LAB and yeasts, was monitored in the cover brines whereas little attention was given on the analysis of the microbiota adhered on the surface of olive drupes forming mixed microbial communities known as biofilms. However, in the last years the focus has been shifted from the brine to olive drupes given that the food finally consumed is the olives whereas the brine is discarded. Hence, the main objective of the present thesis was to study the predisposition of selected starter cultures, mainly LAB and yeasts, to attach on the surface of the drupes and develop biofilms during fermentation, as well as the determination of their survival during the process. Within this concept, selected microorganisms previously isolated from industrially fermented olive brines and reported for their functional properties (Argyri et al. 2013; Bonatsou et al. 2015) were first screened in situ for their ability to exploit the micro-architecture of olive surface for attachment and biofilm formation (Chapter 2). For this purpose, thermally processed (sterilized) table olives lacking the indigenous microbiota and sterile brine solutions with physicochemical conditions (i.e., salt content, pH, acidity, fermentable substrates) resembling the industrial practice were used. The employed microorganisms were the LAB Lactobacillus pentosus B281 and the yeast Pichia membranifaciens M3A. Based on the obtained results, salt concentration in the brine highly affected the growth and dominance of the LAB strain while yeast growth was less affected. In most brining treatments, both strains were able to colonize the olive surface in high numbers ranging from 6.0–7.0 log CFU/g and 5.0–5.5 log CFU/g for L. pentosus B281 and P. membranifaciens M3A, respectively. Aggregates of the inoculated strains on the olive surface were further observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) with microorganisms mostly located in stomal openings and discontinuations of the epidermis. The results showed the predisposition of the selected strains to adhere and form biofilms on olives and gave rise to further investigation on their potential use as starter cultures in fermentation conditions where they would have to compete with the interfering indigenous biota. In this sense, L. pentosus B281 and L. plantarum B282 where used as starters during fermentation of Halkidiki green olives in low (8%) and high (10%) initial salt brines according to Spanish-style processing, while L. pentosus B281 and P. membranifaciens M3A were used as starters during fermentation of Conservolea natural black olives in 8% initial salt brine according to Greek-style processing (Chapters 3 and 4). The use of L. pentosus B281 resulted in a final product with appropriate physicochemical characteristics and good sensory properties in both processing styles. In the case of Spanish-style processing (Chapter 3), strain B281 dominated over strain B282 when they were co-inoculated in the brines regardless of salt concentration, while the latter LAB strain showed low imposition over the indigenous LAB population during processing in high salt (10%) brines. In the case of Greek-style processing, the selected yeast starter could not be recovered from the olive surface at the end of fermentation, despite the high adherence on olives at the onset of the process (100%). However, the presence of the yeast starter resulted in proper fermentation and the final product was characterised by good sensory attributes and a milder acidic taste. In contrast, L. pentosus B282 either as single or combined culture with the yeast statrter could successfully colonize the surface of black olives presenting high recovery rate (100%) at the end of fermentation. Therefore, the use of a mixed starter culture (LAB/yeast) in the fermentation of black olives could result in the development of a final product that could be suitable for consumers who do not appreciate the sour taste of olives and prefer milder tastes. In the present thesis, it was further shown that LAB and yeasts, the fermenting microbiota of table olives, can colonize and form biofilm communities on the surface of plastic vessels where fermentation takes place and most importantly they can be persistent in cleaning treatments (Chapter 5). The most frequently isolated and characterized yeasts belonged to Candida spp., followed by Wickerhamomyces anomalus, Debaryomyces hansenii and Pichia guilliermondii which are common members of the yeast fermenting microbiota of table olives. Regarding LAB species, L. pentosus was the most abundant species recovered from the biofilm. These results showed that biofilm development on the surface of fermentation vessels may serve as a natural means of brine inoculation with the necessary technological microbiota to support fermentation.Η ζύμωση είναι μία από τις παλαιότερες και πλέον διαδεδομένες μεθόδους για την επεξεργασία και συντήρηση των τροφίμων η οποία εμφανίστηκε από τις απαρχές της ανθρωπότητας. Οι επιτραπέζιες ελιές αποτελούν ένα από τα πιο σημαντικά τρόφιμα φυτικής προέλευσης στο Δυτικό κόσμο που καταναλώνονται ως ζυμωμένο προϊόν. Η διαδικασία της ζύμωσης έχει ως βασικό στόχο την μερική ή ολική απομάκρυνση της φαινολικής ουσίας ελευρωπαΐνη, η οποία ευθύνεται για την πικρή γεύση του νωπού ελαιοκάρπου καθιστώντας το μη εδώδιμο, και την ανάπτυξη ενός τελικού προϊόντος με βελτιωμένα οργανοληπτικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά που θα εξασφαλίζουν την μικροβιολογική σταθερότητα του προϊόντος ακόμη και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, αλλά και την αποδοχή του από τον καταναλωτή. Η ζύμωση της επιτραπέζιας ελιάς οφείλεται στην επιλεκτική δράση της αυτόχθονης μικροχλωρίδας του καρπού, με την τελική επικράτηση των οξυγαλακτικών βακτηρίων και των ζυμών. Μέχρι πρόσφατα, η μελέτη της δυναμικής της μικροχλωρίδας κατά τη ζύμωση πραγματοποιείτο αποκλειστικά στην άλμη, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η δυνατότητα των μικροοργανισμών να προσκοληθούν στην επιφάνεια του καρπού και να σχηματίσουν μεικτές βιοκοινότητες γνωστές ως βιοϋμένια. Τα τελευταία χρόνια όμως το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει μετατοπιστεί από την άλμη στον καρπό της ελιάς, δεδομένου ότι το προϊόν που τελικά καταναλώνεται είναι ο καρπός ενώ η μητρική άλμη απορρίπτεται. Ως εκ τούτου, το αντικείμενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της δημιουργίας βιοϋμενίων στην επιφάνεια του ελαιοκάρπου κατά τη ζύμωση με την εφαρμογή επιλεγμένων μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης, καθώς επίσης και ο προσδιορισμός της επιβίωσής τους κατά την επεξεργασία του καρπού. Στο πλαίσιο αυτό, επιλεγμένοι μικροοργανισμοί οι οποίοι είχαν προηγουμένως απομονωθεί από άλμες ζύμωσης ελιάς σε βιομηχανική κλίμακα και μελετηθεί για τις προβιοτικές και τεχνολογικές τους ιδιότητες (Argyri et al. 2013; Bonatsou et al. 2015), εξετάστηκαν αρχικά για την in situ ικανότητά τους να προσκολλώνται στον ελαιόκαρπο και να δημιουργούν βιοϋμένιο (Κεφάλαιο 2). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν θερμικά επεξεργασμένες (αποστειρωμένες) ελιές χωρίς την παρουσία αυτόχθονης μικροχλωρίδας και αποστειρωμένα διαλύματα άλμης με φυσικοχημικές συνθήκες (αλατότητα, pH, οξύτητα, ζυμώσιμα συστατικά) ανάλογες με αυτές που χρησιμοποιεί η μεταποιητική βιομηχανία της επιτραπέζιας ελιάς στη χώρα μας. Οι μικροοργανισμοί που επιλέχθηκαν ως καλλιέργειες εκκίνησης ήταν το οξυγαλακτικό βακτήριο Lactobacillus pentosus B281 και η ζύμη Pichia membranifaciens M3A. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αυξημένη συγκέντρωση άλατος στην άλμη (10%) επηρέασε σε μεγάλο βαθμό την ικανότητα αύξησης του οξυγαλακτικού βακτηρίου, σε αντίθεση με τη ζύμη της οποίας ο πληθυσμός παρουσίασε μικρές διακυμάνσεις. Στις περισσότερες συνθήκες που μελετήθηκαν οι δύο μικροοργανισμοί μπόρεσαν να αποικίσουν τον καρπό σε μεγάλους πληθυσμούς που κυμαίνονταν μεταξύ 6,0–7,0 log CFU/g και 5,0–5,5 log CFU/g για το βακτήριο L. pentosus B281 και τη ζύμη P. membranifaciens M3A, αντίστοιχα. Η παρουσία βιοϋμενίου επάνω στον καρπό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, με τους μικροοργανισμούς να συγκεντρώνονται κυρίως στα στομάτια του καρπού και σε σημεία όπου υπήρχε ασυνέχεια της επιδερμίδας. Από τα εν λόγω αποτελέσματα προέκυψε ότι οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν έχουν την προδιάθεση προσκόλλησης και σχηματισμού βιοϋμενίου στην επιφάνεια του ελαιόκαρπου. Παράλληλα, οδήγησαν στην ανάγκη περαιτέρω μελέτης για τη χρήση τους ως καλλιέργειες εκκίνησης σε συνθήκες ζύμωσης διαφορετικών εμπορικών τύπων επιτραπέζιας ελιάς (πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου, φυσικές μαύρες ελιές) όπου θα έπρεπε να ανταγωνιστούν την υπάρχουσα αυτόχθονη μικροχλωρίδα κατά την επεξεργασία. Σε αυτή τη λογική, τα οξυγαλακτικά βακτήρια L. pentosus B281 και L. plantarum B282 χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως εναρκτήριες καλλιέργειες κατά τη ζύμωση πράσινων ελιών ποικιλίας «Χαλκιδικής» σύμφωνα με την Ισπανική μέθοδο σε αρχική άλμη χαμηλής (8%) και υψηλής (10%) αλατοπεριεκτικότητας, ενώ το βακτήριο L. pentosus B281 και η ζύμη P. membranifaciens M3A χρησιμοποιήθηκαν ως εναρκτήριες καλλιέργειες κατά τη ζύμωση φυσικής μαύρης ελιάς ποικιλίας «Κονσερβολιά» σε αρχική άλμη 8%, σύμφωνα με την πρακτική που εφαρμόζεται από τη βιομηχανία στη χώρα μας (Κεφάλαια 3 και 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρήση του βακτηρίου L. pentosus B281 οδήγησε στη δημιουργία τελικού προϊόντος με επιθυμητά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και καλές οργανοληπτικές ιδιότητες τόσο στην επεξεργασία ισπανικού τύπου όσο και στη ζύμωση της φυσικής μαύρης ελιάς. Στην περίπτωση της ζύμωσης ισπανικού τύπου (Κεφάλαιο 3), το βακτήριο L. pentosus Β281 επικράτησε του L. plantarum Β282 όταν ενοφθαλμίστηκαν στην άλμη ως συγκαλλιέργεια ανεξάρτητα από την αρχική αλατότητα της άλμης, ενώ το δεύτερο στέλεχος, όταν εμβολιάστηκε ως μονοκαλλιέργεια σε άλμη υψηλής αλατότητας (10%) επέδειξε χαμηλή ικανότητα επικράτησης έναντι της αυτόχθονης μικροχλωρίδας των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Στην περίπτωση της ζύμωσης φυσικής μαύρης ελιάς, το επιλεγμένο στέλεχος της ζύμης, παρά το υψηλό ποσοστό προσκόλλησης στον καρπό στο αρχικό στάδιο της επεξεργασίας (100%), δεν κατάφερε να επικρατήσει και να ανακτηθεί στο τέλος της ζύμωσης. Ωστόσο, η χρήση οδήγησε σε φυσιολογική ζύμωση με το τελικό προϊόν να χαρακτηρίζεται από καλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και ήπια αίσθηση της οξύτητας. Αντίθετα, το βακτήριο L. pentosus B282, είτε ως μονοκαλλιέργεια είτε ως συγκαλλιέργεια με τη ζύμη, επικράτησε κατά την επεξεργασία και ανακτήθησε σε ποσοστό 100% στο τέλος της ζύμωσης. Επομένως, η εφαρμογή μικτής καλλιέργειας εκκίνησης (οξυγαλακτικού βακτηρίου/ζύμης) κατά τη ζύμωση του φυσικού μαύρου ελαιόκαρπου θα μπορούσε να συμβάλλει στη δημιουργία ενός τελικού προϊόντος με ήπια γεύση που απευθύνεται σε καταναλωτές που δεν εκτιμούν ιδιαίτερα την όξινη γεύση στην επιτραπέζια ελιά.Στη συνέχεια, μελετήθηκε η δυνατότητα προσκόλλησης της αυτόχθονης μικροχλωρίδας και η δημιουργία βιοϋμενίου στην επιφάνεια της δεξαμενής ζύμωσης, καθώς επίσης και ο ποσοτικός και ποιοτικός χαρακτηρισμός των μικροοργανισμών του βιοϋμενίου σε διαφορετικές συνθήκες εξυγίανσης της δεξαμενής (Κεφάλαιο 5). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μικροοργανισμοί που αποτελούν την επικρατούσα μικροχλωρίδα κατά τη ζύμωση, οξυγαλακτικά βακτήρια και ζύμες, έχουν την ικανότητα προσκόλλησης στην εσωτερική επιφάνεια του περιέκτη και δημιουργία βιοϋμενίων τα οποία επιβιώνουν έναντι των συνθηκών απολύμανσης. Κατά το χαρακτηρισμό του πληθυσμού των ζυμών βρέθηκε ότι τα πιο συχνά απαντώμενα είδη ήταν Candida spp. ακολουθούμενα από τα είδη Wickerhamomyces anomalus, Debaryomyces hansenii και Pichia guilliermondii, ενώ όσον αφορά στο χαρακτηρισμό των οξυγαλακτικών βακτηρίων, το βακτήριο L. pentosus ήταν το πιο συχνά ευρισκόμενο είδος. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δημιουργία βιοϋμενίων στην επιφάνεια των δεξαμενών ζύμωσης μπορεί να λειτουργήσει ως ένας φυσικός τρόπος ενοφθαλμισμού της άλμης με μικροοργανισμούς που διαθέτουν τα κατάλληλα τεχνολογικά χαρακτηριστικά για να υποστηρίξουν τη ζύμωση

Microbial Diversity of Fermented Greek Table Olives of Halkidiki and Konservolia Varieties from Different Regions as Revealed by Metagenomic Analysis

Current information from conventional microbiological methods on the microbial diversity of table olives is insufficient. Next-generation sequencing (NGS) technologies allow comprehensive analysis of their microbial community, providing microbial identity of table olive varieties and their designation of origin. The purpose of this study was to evaluate the bacterial and yeast diversity of fermented olives of two main Greek varieties collected from different regions—green olives, cv. Halkidiki, from Kavala and Halkidiki and black olives, cv. Konservolia, from Magnesia and Fthiotida—via conventional microbiological methods and NGS. Total viable counts (TVC), lactic acid bacteria (LAB), yeast and molds, and Enterobacteriaceae were enumerated. Microbial genomic DNA was directly extracted from the olives’ surface and subjected to NGS for the identification of bacteria and yeast communities. Lactobacillaceae was the most abundant family in all samples. In relation to yeast diversity, Phaffomycetaceae was the most abundant yeast family in Konservolia olives from the Magnesia region, while Pichiaceae dominated the yeast microbiota in Konservolia olives from Fthiotida and in Halkidiki olives from both regions. Further analysis of the data employing multivariate analysis allowed for the first time the discrimination of cv. Konservolia and cv. Halkidiki table olives according to their geographical origin

Population dynamics of <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> in the host’s hemolymph.

<p>Larvae were injected with live (A,C) or heat-killed (B,D) cells of <i>L</i>. <i>pentosus</i> B281 (white bars), <i>L</i>. <i>plantarum</i> B282 (dotted bars) and <i>L</i>. <i>rhamnosus</i> LGG (grey bars). Infection with the pathogen took place at 6 (A, B) and 24 h (C, D) post LAB administration. Black bars correspond to the control group. Bars with asterisks show groups with significant differences in comparison with the control group with a <i>p</i>-value ≤ 0.05. A total of 30–35 larvae were used for each treatment in order to determine the population of the pathogen in the hemolymph.</p

Significant differences as determined by <i>t</i> test for paired samples in the case of <i>Staphylococcus aureus</i> infection.

<p>Significant differences as determined by <i>t</i> test for paired samples in the case of <i>Staphylococcus aureus</i> infection.</p

Investigating the Effect of Different Treatments with Lactic Acid Bacteria on the Fate of <i>Listeria monocytogenes</i> and <i>Staphylococcus aureus</i> Infection in <i>Galleria mellonella</i> Larvae

<div><p>The use of <i>Galleria mellonella</i> as a model host to elucidate microbial pathogenesis and search for novel drugs and therapies has been well appreciated over the past years. However, the effect of microorganisms with functional appeal in the specific host remains scarce. The present study investigates the effect of treatment with selected lactic acid bacteria (LAB) with probiotic potential, as potential protective agents by using live or heat-killed cells at 6 and 24 h prior to infection with <i>Listeria monocytogenes</i> and <i>Staphylococcus aureus</i> or as potential therapeutic agents by using cell-free supernatants (CFS) after infection with the same pathogens. The employed LAB strains were <i>Lactobacillus pentosus</i> B281 and <i>Lactobacillus plantarum</i> B282 (isolated from table olive fermentations) along with <i>Lactobacillus rhamnosus</i> GG (inhabitant of human intestinal tract). Kaplan-Meier survival curves were plotted while the pathogen’s persistence in the larval hemolymph was determined by microbiological analysis. It was observed that the time (6 or 24 h) and type (live or heat-killed cells) of challenge period with LAB prior to infection greatly affected the survival of infected larvae. The highest decrease of <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> population in the hemolymph was observed in groups challenged for 6 h with heat-killed cells by an average of 1.8 log units compared to non challenged larvae for strains B281 (<i>p</i> 0.0322), B282 (<i>p</i> 0.0325), and LGG (<i>p</i> 0.0356). In the case of <i>S</i>. <i>aureus</i> infection, the population of the pathogen decreased in the hemolymph by 1 log units at 8 h post infection in the groups challenged for 6 h with heat-killed cells of strains B281 (<i>p</i> 0.0161) and B282 (<i>p</i> 0.0096) and by 1.8 log units in groups challenged with heat-killed cells of LGG strain (<i>p</i> 0.0175). Further use of CFS of each LAB strain did not result in any significant prolonged survival but interestingly it resulted in pronounced decrease of <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> in the hemolymph at 24 h and 48 h after infection by more than 1 log unit (<i>p</i> < 0.05) depending on the strain. The results of the present work support the broader use of <i>G</i>. <i>mellonella</i> larvae as a low cost <i>in vivo</i> tool for screening for probiotic properties.</p></div

In Vitro Gene Transcription of Listeria monocytogenes after Exposure to Human Gastric and Duodenal Aspirates

The aim of the present study was to assess, for the first time to our knowledge, Listeria monocytogenes CFU changes, as well as to determine the transcription of key virulence genes, namely, sigB, prfA, hly, plcA, plcB, inlA, inlB, inlC, inlJ, inlP, and lmo2672 after in vitro exposure to human gastric and duodenal aspirates. Furthermore, investigations of the potential correlation between CFU changes and gene regulation with factors influencing gastric (proton pump inhibitor intake and presence of gastric atrophy) and duodenal pH were the secondary study aims. Gastric and duodenal fluids that were collected from 25 individuals undergoing upper gastrointestinal endoscopy were inoculated with L. monocytogenes serotype 4b strain LQC 15257 at 9 log CFU•mL-1 and incubated at 378C for 100 min and 2 h, respectively, with the time corresponding to the actual exposure time to gastric and duodenal fluids in the human gastrointestinal tract. Sampling was performed upon gastric fluid inoculation, after incubation of the inoculated gastric fluids, upon pathogen resuspension in duodenal fluids and after incubation of the inoculated duodenal fluids. L. monocytogenes CFU changes were assessed by colony counting, as well as reverse transcription quantitative PCR by using inlB as a target. Gene transcription was assessed by reverse transcription quantitative PCR. In 56% of the cases, reduction of the pathogen CFU occurred immediately after exposure to gastric aspirate. Upregulation of hly and inlC was observed in 52 and 58% of the cases, respectively. On the contrary, no upregulation or downregulation was noticed regarding sigB, prfA, plcA, plcB, inlA, inlB, inlJ, inlP, and lmo2672. In addition, sigB and plcA transcription was positively and negatively associated, respectively, with an increase of the pH value, and inlA transcription was negatively associated with the presence of gastric atrophy. Finally, a positive correlation between the transcriptomic responses of plcB, inlA, inlB, inlC, inlJ, inlP, and lmo2672 was detected. This study revealed that the CFU of the pathogen was negatively affected after exposure to human gastroduodenal aspirates, as well as significant correlations between the characteristics of the aspirates with the virulence potential of the pathogen. © 2020 International Association for Food Protection. All rights reserved

Significant differences as determined by <i>t</i> test for paired samples in the case of <i>Listeria monocytogenes</i> infection.

<p>Significant differences as determined by <i>t</i> test for paired samples in the case of <i>Listeria monocytogenes</i> infection.</p

Population dynamics of <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> and <i>S</i>. <i>aureus</i> in <i>G</i>. <i>mellonella</i> hemolymph after treatment with LAB CFS.

<p>Larvae were infected with (A) <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> and (B) <i>S</i>. <i>aureus</i> and susequently treated with 1/10 CFS of cultures of B281, B282 and LGG LAB strains. Bars with asterisks show groups with significant differences in comparison with the control group with a <i>p</i>-value ≤ 0.05. A total of 30–35 larvae were used for each treatment in order to determine the population of the pathogen in the hemolymph.</p

Kaplan-Meier survival plots of <i>G</i>. <i>mellonella</i> larvae by <i>L</i>. <i>monocytogenes</i> infection.

<p>Larvae were previously administered with 10⁴ live (<b>A, C</b>) and heat-killed (<b>B, D</b>) cells of <i>L</i>. <i>pentosus</i> B281(L_B281), <i>L</i>. <i>plantarum</i> B282 (L_B282) and <i>L</i>. <i>rhamnosus</i> LGG (L_LGG). LAB administration was performed at 6 (<b>A, B</b>) and 24 h (<b>C, D</b>) prior to infection. All groups from each treatment were compared with the control group using the log rank test. The corresponding <i>p</i>-values are given in the parenthesis for each group. Groups of 16 larvae were used for the killing assays.</p

Kaplan-Meier survival plots of <i>G</i>. <i>mellonella</i> larvae by <i>S</i>. <i>aureus</i> infection.

<p>Larvae were previously administered with 10⁴ live (<b>A, C</b>) and heat-killed (<b>B, D</b>) cells of <i>L</i>. <i>pentosus</i> B281(L_B281), <i>L</i>. <i>plantarum</i> B282 (L_B282) and <i>L</i>. <i>rhamnosus</i> LGG (L_LGG). LAB administration was performed at 6 (<b>A, B</b>) and 24 h (<b>C, D</b>) prior to infection. All groups from each treatment were compared with the control group using the log rank test. The corresponding <i>p</i>-values are given in the parenthesis for each group. Groups of 16 larvae were used for the killing assays.</p