Caracterização de alterações moleculares em tumores do pâncreas e região periampular

A ampola de Vater é uma área de convergência do ducto biliar comum, do ducto pancreático e do duodeno. A região periampular dista em torno de 2cm da ampola de Vater e neoplasias que se originam nesta região são denominadas carcinomas periampulares (CPs). Os CPs incluem quatro grupos tumorais originados da cabeça do pâncreas, da ampola de Vater, ducto biliar distal ou do duodeno e correspondem a 0,5% de todas as neoplasias digestivas. Tumores originados no pâncreas são mais frequentes entre os CPs e estes têm as maiores taxas de mortalidade sendo representados majoritariamente pelo adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), subtipo histológico mais frequente e agressivo. Tumores mais raros como os outros CPs também apresentam altas taxas de mortalidade, mas são menos estudados quanto às suas alterações genéticas e epigenéticas, biologia tumoral e influência de fatores genéticos no prognóstico. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização molecular do adenocarcinoma ductal pancreático e de tumores periampulares com o objetivo de contribuir para melhor compreensão do processo de carcinogênese e identificar marcadores prognósticos relacionados a esses tumores. Inicialmente, avaliamos o perfil de metilação do DNA no ADP em busca de potenciais alvos terapêuticos nas vias moleculares associadas à carcinogênese. Verificamos que o ADP apresenta genes diferencialmente metilados em relação ao tecido normal adjacente e identificamos diversos genes da via de sinalização do cálcio diferencialmente metilados, e muitos destes são compartilhados com outras vias-chave da carcinogênese pancreática, como as vias Ras e Hippo. Os genes ADCY8, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1H, e RYR3, que controlam o influxo de Ca+2 da membrana plasmática no retículo endoplasmático rugoso, estavam mais frequentemente hipermetilados e, mediante análise in silico de dados do TCGA, observamos que a redução da expressão desses genes se mostrou associada à redução da sobrevida global nos pacientes. Este achado é relevante, pois pode indicar potenciais marcadores prognósticos e alvos terapêuticos para casos selecionados de ADP. Adicionalmente, os resultados obtidos nesta tese indicam que a via de sinalização 13 do cálcio parece ter um papel importante desde as etapas muito iniciais da carcinogênese pancreática. Quanto aos outros CPs, pouco se sabe a respeito da modulação epigenética regulada pelas desacetilases de histonas (HDACs). Assim, caracterizamos o perfil de expressão das HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 nestas neoplasias, bem como investigamos o possível papel das mesmas no desenvolvimento dos carcinomas de ampola de Vater (CAVs). Utilizamos bancos de dados de expressão para avaliar o perfil das HDACs e segundo nosso conhecimento, este foi o primeiro estudo a avaliar a sua expressão no adenocarcinoma duodenal. Os CAVs e os adenocarcinomas duodenais apresentaram um perfil de expressão semelhante paras HDAC1 e HDAC2. Esse trabalho ainda avaliou, pela primeira vez, a expressão proteica das HDACs em amostras de adenocarcinoma de ampola de Vater (o subtipo histológico mais frequente) e tecidos normais adjacentes (pancreático, ampular e duodenal). Encontramos um perfil de expressão semelhante entre todos os tecidos, sugerindo que estas HDACs não estão diretamente envolvidas na carcinogênese do CAVs, embora possam ter um papel auxíliando o fenótipo tumoral, modulando genes envolvidos proliferação celular, regulação do ciclo celular e apoptose. Por fim, descrevemos um caso clínico atípico e mais grave de Neurofibromatose 1 com múltiplos tumores periampulares onde a presença de duas variantes germinativas patogênicas em genes distintos (NF1 e CFTR) relacionados a doenças pâncreáticas podem ter agido sinergicamente. Em especial, a variante germinativa patogênica do gene CFTR associada ao pâncreas divisum pode ter contribuído para a ocorrência de múltiplos tumores na paciente portadora de Neurofibromatose tipo 1. Este relato de caso reforça a importância de uma análise molecular mais abrangente, incluindo avaliação de múltiplos genes relacionados ao fenótipo em casos atípicos ou com fenótipo mais grave que o habitual. A informação obtida no estudo de caso será também muito relevante para os familiares do caso índice. Os resultados desta tese contribuem para o melhor entendimento do perfil genético e epigenético dos adenocarcinomas ductais pancreáticos e de carcinomas 14 periampulares. Os resultados também indicam importantes linhas de investigação para explorar novas vias de sinalização que possam trazer informações relevantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.Ampulla of Vater is a convergence area of the common bile duct, pancreatic duct, and duodenum. The periampullary region is located within about 2 cm from the ampulla of Vater and neoplasms originated in this region are called periampullary carcinomas (PCs). PCs include four tumoral groups that arise from the pancreatic head, Ampulla of Vater, distal biliary duct or duodenum and correspond to 0.5% of all digestive neoplasms. Tumors originated in the pancreas are the most frequent among PCs and they have the highest mortality rates, being represented mainly by the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most frequent and aggressive histological subtype. Other PCs are rarer and also have high mortality rates, however, their genetic and epigenetic alterations, tumor biology, and genetic influence in prognostic factors are less studied. In this context, the objective of this study was to perform a molecular characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma and periampullary tumors in order to contribute to a better understanding of the carcinogenesis process and to identify prognostic markers related to these tumors. First, we evaluated the DNA methylation profile in PDAC samples, searching for potential therapeutic targets in the molecular pathways associated with PDAC carcinogenesis. PDAC showed differentially methylated genes compared to adjacent normal tissue and we identified several differentially methylated genes in the Calcium Signaling Pathway. Many of these are shared with other key pancreatic carcinogenesis pathways, such as the Ras and Hippo pathways. The ADCY8, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1H, and RYR3 genes, which control Ca2+ influx into the rough plasma membrane or endoplasmic reticulum, were most often hypermethylated. Using in silico analysis of TCGA data, we observed that reduced expression of these genes was associated with reduced overall survival in PDAC patients. This finding is relevant as may indicate potential prognostic markers and therapeutic targets for selected PDAC cases. Additionally, the results obtained in this thesis indicate that the calcium signaling pathway seems to play an important role since the very early stages of pancreatic carcinogenesis. 16 In relation to other PCs, there is little knowledge about epigenetic modulation regulated by histone deacetylases (HDACs). Thus, we characterized the expression profile of HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC7 in these neoplasms, as well as investigated their possible role in the development of ampulla of Vater carcinomas (AVCs). We used expression databases to evaluate the profile of HDACs, and to our knowledge, this was the first study to evaluate their expression in duodenal adenocarcinoma. AVCs and duodenal adenocarcinomas showed a similar expression profile for HDAC1 and HDAC2. This work also evaluated, for the first time, the protein expression of HDACs in AVCs samples (the most common histological subtype) and adjacent normal tissues (pancreatic, ampullary and duodenal). We found a similar expression profile among all tissues, suggesting that these HDACs are not directly involved in the AVCs carcinogenesis. Nonetheless, they may play a role supporting the tumor phenotype by modulating genes involved in cell proliferation, cell cycle regulation and apoptosis. Finally, we described an atypical and more severe case of Neurofibromatosis 1 with multiple periampullary tumors, where the presence of two pathogenic germline variants in different genes (NF1 and CFTR) related to pancreatic diseases may have acted synergistically. In particular, the CFTR pathogenic germline variant associated with pancreas divisum may have contributed to the occurrence of multiple tumors in the Neurofibromatosis type 1 patient. This case report reinforces the importance of a broader molecular analysis, including evaluation of multiple genes related to phenotype, in atypical cases or with more severe phenotype than usual. The information obtained from the case report will also be very relevant to the case index relatives. The thesis results contribute to a better understanding of the genetic and epigenetic profile of pancreatic ductal adenocarcinomas and periampullary carcinomas. The results also indicate important research topics to be explored, including new signaling pathways that may provide relevant information for the development of new therapeutic strategies

Letra internacional: Número 54 - 1998 Enero

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Avaliação da expressão dos genes HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 e seus possíveis mecanismos de silenciamento no adenocarcinoma ductal pancreático

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença altamente letal e agressiva. Alteração no perfil de acetilação das histonas envolvendo desacetilases de histonas (HDAC), assim como modificações da expressão de miRNAs podem levar ao desenvolvimento tumoral. Neste estudo, foi avaliada a expressão das HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 em ADP e amostras de tecido pancreático não tumoral (TN) usando análises experimentais e de banco de dados. Os níveis de expressão foram correlacionados com características clínico-patológicas dos pacientes e foi realizada uma investigação in silico de miRNAs reguladores de efeito das HDACs. Os níveis de expressão das HDACs foram avaliadas por qRT-PCR a partir de 25 amostras de ADP e 23 amostras de TN e a análise da expressão diferencial (ED) e correlação entre HDACs e miRNAs em ADP foi realizada utilizando perfis de expressão de seis microarranjos do Gene Expression Omnibus. Potenciais relações miRNA-HDACs foram coletadas em bases de dados de interação de miRNAs. Um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Encontramos expressão reduzida em ADP comparado com TN para todas as HDACs analisadas, com P<0,05 para HDAC1, 2 e 3. Entretanto, os fold-changes foram muito baixos e provavelmente sem relevância biológica, e a expressão da HDAC2 e HDAC7 foi correlacionada com a idade ao diagnóstico. Nenhuma outra correlação entre a expressão das HDACs e características clínico-patológicas foi identificada. Análises de ED sugeriram significativa superexpressão das HDAC1, 2 e 7 e subexpressão da HDAC3, contudo todas apresentaram fold-changes pequenos. As análises dos bancos de dados identificaram 728 miRNAs como reguladores das HDACs. Interseções entre os conjuntos de miRNAs (GSE41369 e GSE43796) e aqueles recuperados da análise de expressão diferencial indicaram cinco miRNAs que influenciam a HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR -4269 e miR-3616-3p) e três que influenciam a HDAC2 (miR-4307, miR-944 e miR-195). A expressão das HDACs provavelmente não é um biomarcador de prognóstico robusto para o ADP, uma vez que a expressão diferencial entre os grupos é sutil. Ainda, este e estudos anteriores indicam nenhuma ou pouca associação entre a expressão HDACs e características clínico-patológicas relacionadas com o prognóstico. Finalmente, miRNAs provavelmente não estão exercendo um papel central na regulação da HDACs no ADP.Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal and aggressive disease. The disruption of histone acetylation through histones deacetylases (HDACs) and expression regulation by miRNAs can lead to tumor development. In this study we assessed HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC7 expression in PDAC and non-tumoral tissue (NT) samples using experimental and databases analysis, correlated their expression levels with clinical and pathological features in patients and performed in silico investigation of HDACs regulation by miRNAs. Expression levels of HDACs were measured by qRT-PCR from 25 PDAC and 23 NT. An analysis of differential expression (DE) and correlation of HDACs and miRNAs in PDAC was performed using six Gene Expression Omnibus microarray datasets. Potential miRNA-HDACs relationships were collected from miRNA interaction databases. A P<0.05 was considered statistically significant. We found reduced expression in PDAC compared with NT for HDAC1, HDAC2 and HDAC3, with P<0.05. Expression levels of HDAC7 did not significantly differ between groups. However, fold-changes were very small and probably not biologically relevant. Only HDAC2 and HDAC7 were associated with age at diagnosis and no other associations between HDAC expression and clinical features were identified. DE analysis suggested significant up-regulation of HDAC1, HDAC2 and HDAC7, and down-regulation of HDAC3, albeit all of them associated with small fold changes. Databases analysis identified 728 miRNAs that could be HDACs regulators. Intersections among the set of miRNAs found in differential expression analysis of GSE41369 and GSE43796 and those retrieved from target prediction identified five miRNAs targeting HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR-4269 and miR-3616-3p) and three targeting HDAC2 (miR-4307, miR-944 and miR-195). HDACs expression is likely not a robust prognostic biomarker in PDAC since differential expression between groups is subtle. Also, this and previous studies indicate no or only very few associations between HDACs expression and clinicopathological features related to prognosis. Finally, miRNAs are probably not exerting a central role in HDAC regulation in PDAC