Eisosome organization in the filamentous ascomycete Aspergillus nidulans

Eisosomes are subcortical organelles implicated in endocytosis and have hitherto been described only in Saccharomyces cerevisiae. They comprise two homologue proteins, Pil1 and Lsp1, which colocalize with the transmembrane protein Sur7. These proteins are universally conserved in the ascomycetes. We identify in Aspergillus nidulans (and in all members of the subphylum Pezizomycotina) two homologues of Pil1/Lsp1, PilA and PilB, originating from a duplication independent from that extant in the subphylum Saccharomycotina. In the aspergilli there are several Sur7-like proteins in each species, including one strict Sur7 orthologue (SurG in A. nidulans). In A. nidulans conidiospores, but not in hyphae, the three proteins colocalize at the cell cortex and form tightly packed punctate structures that appear different from the clearly distinct eisosome patches observed in S. cerevisiae. These structures are assembled late during the maturation of conidia. In mycelia, punctate structures are present, but they are composed only of PilA, while PilB is diffused in the cytoplasm and SurG is located in vacuoles and endosomes. Deletion of each of the genes does not lead to any obvious growth phenotype, except for moderate resistance to itraconazole. We could not find any obvious association between mycelial (PilA) eisosome-like structures and endocytosis. PilA and SurG are necessary for conidial eisosome organization in ways that differ from those for their S. cerevisiae homologues. These data illustrate that conservation of eisosomal proteins within the ascomycetes is accompanied by a striking functional divergence. © 2010, American Society for Microbiology.This work was supported by research grants from the NCSR Demokritos to I.V. and IKY to C.G.Peer Reviewe

Regulation of expression and structure-function relationships of purine transporters

The present Thesis’s initiative was the investigation of structure-function relationships and the post-tranlational regulation of exression of the UapA uric acid-xanthine transporter of Aspergillus nidulans, the prototypic member of the NAT family of Nucleobase-Ascorbate Transporters.In order to further investigate and better understand the translocation mechanism of UapA, the role of three conserved polar amino acid residues, Glu356, Gln382 and Lys439, was studied. These residues were substituted, using in vitro site-directed mutagenesis, by other residues of similar a) structural or b) functional character, and c) of non-polar nature. In addition, more substitutions were made having in mind amino acid residues of the same position on other NAT members of known function. Mutant proteins were extensively studied using physiological growth tests, epifluoresence microscopy and radiolabelled substrate uptake measurements, in order to evaluate changes in their kinetic profile. The results imply that Q382 and Lys439 are not important for the function of UapA, since they do not contribute consideralby in the determination of the transporter’s kinetic characteristics. Glu356, absolutely conserved in the NAT family, is absolutely necessary for the translocation of the substrate and seems to contribute, directly or indirectly, to the binding of the substrate via functional interactions during the transport cycle.On the post-transcriptional regulation of the transporter, the UapA downregulation phenomenon by its substrates and the mechanism of its endocytosis by ubiquitinylation were studied. In patricular, it was shown that UapA, in the presence of its substates, is endocytosed from the plasma membrane, sorted into endosomes and targered for degradation in the vacuole. The use of substrate analogues and loss of function UapA mutants showed that substrate-induced endocytosis is absolutely dependent on the functionality of the transporter. Substrate binding is not enough to cause endocytosis, as translocation through UapA is required. The use of mutant strains in the UaY purine pathway-specific positive transcriptional regulator showed that transcriptional induction is not connected with substrate-induced endocytosis. High cytoplasmic concentrations of uric acid do not consitute a signal for endocytosis as well, as UapA plasma membrane localisation is unaffected in a loss of function mutant of the uricase, thas has elevated uric acid concentration. Concetration of uric acid in this strain, measured by HPLC, is 10-fold increased compared to the wild type and 20 fold the minimum required to elicit substrate-induced endocytosis. Finally, the use of UapA isoforms with altered kinetic and/or specificity further confirmed that substrate translocation is necessary for endocytosis, and provided evidence that the signal for endocytosis is generated by subtle structural conformations of the transporter during the completation of the transport cycle.In regard to the mechanism that endocytosis is achieved, the contribution of the HulARsp5 ubiquitin ligase was studied. Deletion of hulA was lethal, and its replacement by a mutant isoform was carried out. This isoform (HulAΔC2) lacks the C2 domain, responsible for the interaction with phospholipids, and has been shown in other organisms to be defficient for transporter ubiquitinylation. In the hulaΔC2 strain, UapA is stabilised at the plasma membrane during substrate or ammonium addition. Ammonium is a preferable nitrogen source and its addition was previouly shown to cause UapA downregulation and degradation in the vacuole. Moreover, HulA was shown to ubiquitinylate UapA in Lys572, as seen in Western expreriments by lower mobility UapA bands, absolutely dependent on HulA and Lys572. Substrate-induced endocytosis was also shown to occur in trans, as inactive UapA molecules can be endocytosed in the simultaneous presence of active UapA molecules, even if the latter cannot be endocytosed themselves. This in trans endocytosis does not necessarily lead to vacuolar degradation and is also dependent on ubiquitination. This phenomenon proposes the involvent of a signal transduction pathway or the organization of UapA molecules in plasma membrane microdomains, or even their homo-oligomerization. Filipin staining of ergosterol-rich membrane compartments and detergent-dependent extraction of UapA molecules, however, showed that UapA is not locasised in known plasma membrane microdomains, like MCC or eisosomes. This work forms the basis for the further understanding of UapA regulated trafficking. The involvment of HulA suggests that the type and intracellular locus of ubiquitination possibly regulate the transporter’s sorting. In addition, the involvement of ubiquitin ligase adaptors is evident, since UapA, like most transporters studied, does not possess any known motives for the direct interaction with HulA. The fact that distinct endocytic signals converge to the same ligase suggests the involvement of different adaptor molecules. Finally, the in trans endocytosis phenomenon means that there is a possibility of UapA oligomerization. The state of this possible oligomerization could participate in the intracellular trafficking of the transporter.Η παρούσα διατριβή είχε ως σκοπό τη διερεύνηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας και του μηχανισμού μετα-μεταφραστικής ρύθμισης της έκφρασης του UapA μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης του Aspergillus nidulans, πρότυπου μέλους της οικογένειας μεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων-Ασκορβικού οξέος (Nucleobase-Ascorbate Transporters, NAT). Για την περαιτέρω διερεύνηση και καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας του UapA, μελετήθηκε ο ρόλος τριών συντηρημένων πολικών αμινοξικών καταλοίπων, των Glu356, Gln382 και Lys439. Τα κατάλοιπα αυτά υποκαταστάθηκαν με in vitro στοχευόμενη μεταλλαξιγένεση σε αμινοξικά κατάλοιπα με πλευρικές ομάδες παρόμοιου α) δομικού ή β) λειτουργικού χαρακτήρα, και γ) ουδέτερου χαρακτήρα ως προς το φορτίο ή την ικανότητα αλληλεπίδρασης. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν υποκαταστάσεις σε αμινοξικά κατάλοιπα που βρίσκονται στις συγκεκριμένες θέσεις των πρωτοταγών αλληλουχιών άλλων μεταφορέων της οικογένειας ΝΑΤ με γνωστή λειτουργία. Τα μεταλλαγμένα αλλήλια μελετήθηκαν εκτεταμένα με δοκιμασίες ανάπτυξης, μικροσκοπία επιφθορισμού και μελέτες πρόσληψης ραδιοσημασμένου υποστρώματος για τον καθορισμό των αλλαγών της λειτουργίας και κινητικής τους συμπεριφοράς. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν υποδηλώνουν πως τα Gln382 και Lys439 δεν είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του μεταφορέα αφού δεν συμμετέχουν σημαντικά στον καθορισμό των κινητικών του χαρακτηριστικών. Το Glu356, απολύτως συντηρημένο στην οικογένεια, είναι απολύτως απαραίτητο για την ικανοποιητική ταχύτητα μεταφοράς των υποστρωμάτων, ενώ φαίνεται να συμμετέχει, άμεσα ή έμμεσα, στη δέσμευση των υποστρωμάτων και σε λειτουργικές αλληλεπιδράσεις κατά την ολοκλήρωση του κύκλου μεταφοράς. Όσον αφορά τη μετα-μεταφραστική ρύθμιση του μεταφορέα, μελετήθηκαν το φαινόμενο της αρνητικής του ρύθμισης από τα υποστρώματά του και ο μηχανισμός ενδοκύτωσής του μέσω ουβικουιτινυλίωσης. Πιο συγκεκριμένα, δείχθηκε πως ο UapA, κατά την προσθήκη υποστρωμάτων του στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, ενδοκυτώνεται από την πλασματική μεμβράνη του μύκητα μέσω διαλογής στα ενδοσώματα και τελικά οδηγείται στο χυμοτόπιο προς αποικοδόμηση. Χρήση αναλόγων υποστρώματος και μεταλλαγμένων αλληλίων πλήρους απώλειας λειτουργίας έδειξαν πως η ενδοκύτωση είναι απολύτως εξαρτώμενη της λειτουργίας του μεταφορέα. Απαραίτητη είναι αυτή καθαυτή η μεταφορά του υποστρώματος δια μέσου αυτού και όχι απλώς η δέσμευση αναλόγων υποστρωμάτων που δεν μεταφέρονται. Η χρήση στελεχών που φέρουν μεταλλαγές που επηρεάζουν τη λειτουργία του θετικού μεταγραφικού ρυθμιστή του μονοπατιού καταβολισμού πουρινών, UaY, έδειξε πως η μεταγραφική αυτή επαγωγή δεν σχετίζεται με την ενδοκύτωση από υπόστρωμα. Χρήση στελέχους που φέρει μεταλλαγή πλήρους απώλειας λειτουργίας της ουρικάσης έδειξε πως υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις ουρικού οξέος δεν αποτελούν σήμα για την ενδοκύτωση του UapA. Η συγκέντρωση του ουρικού οξέος στο συγκεκριμένο στέλεχος μετρήθηκε με χρήση HPLC να είναι 10 περίπου φορές μεγαλύτερη από αυτή στελέχους φυσικού τύπου και 20 φορές από την ελάχιστη που είναι ικανή να προκαλέσει ενδοκύτωση όταν παρασχεθεί εξωκυτταρικά. Τέλος, η μελέτη της ενδοκύτωσης από υπόστρωμα μεταλλαγμένων μορφών του μεταφορέα με τροποποιημένη κινητική ή/και εξειδίκευση επιβεβαίωσε περαιτέρω την αναγκαιότητα μεταφοράς για την πρόκληση ενδοκύτωσης, ενώ έδωσε ενδείξεις πως το σήμα για την ενδοκύτωση προκαλείται από δυναμικές δομικές διαμορφώσεις του μεταφορέα κατά την ολοκλήρωση του κύκλου μεταφοράς. Σχετικά με το μηχανισμό που πραγματοποιείται η ενδοκύτωση, μελετήθηκε η εμπλοκή της HulARsp5 λιγάσης της ουβικουιτίνης. Πραγματοποιήθηκε απαλοιφή του γονιδίου της HulA, η οποία αποδείχθηκε θνησιγόνος, αλλά και αντικατάσταση του γονιδίου της από ένα που κωδικοποιεί για μια μορφή μειωμένης λειτουργίας της. Η μορφή αυτή (HulAΔC2) αφορά την απαλοιφή της C2 περιοχής της, η οποία έχει δειχθεί σε ομόλογά της σε άλλους οργανισμούς να είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδρασή της με φωσφολιπίδια της μεμβράνης και κατά συνέπεια για την ικανότητα ουβικουιτινυλίωσης διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Στο στέλεχος που φέρει την hulaΔC2 μεταλλαγή o UapA δείχθηκε να παραμένει στην πλασματική μεμβράνη, τόσο κατά την προσθήκη ουρικού οξέος, όσο και κατά την προσθήκη αμμωνιακών ιόντων, μια προτιμώμενη για το μύκητα πηγή αζώτου, προσθήκη της οποίας είχε δειχθεί παλαιότερα να οδηγεί το μεταφορέα προς αποικοδόμηση στο χυμοτόπιο. Η HulA δείχθηκε να ουβικουιτινυλιώνει το μεταφορέα στην Lys572, αφού κατέστη δυνατή η απομόνωση ζωνών μειωμένης κινητικότητας άμεσα εξαρτώμενων από την Lys572, οι οποίες απουσιάζουν επίσης σε στέλεχος HulAΔC2.H πρόκληση ενδοκύτωσης από υπόστρωμα δείχθηκε να είναι δυνατή και in trans, αφού ανενεργά μόρια UapA ενδοκυτώνονται από υπόστρωμα παρουσία ενός ενεργού, έστω με ανικανότητα ουβικουιτινυλίωσης μορίου. Η ενδοκύτωση αυτή δεν οδηγεί απαραίτητα σε αποικοδόμηση του μεταφορέα στο χυμοτόπιο και είναι επίσης εξαρτώμενη από ουβικουιτινυλίωση. Το φαινόμενο της in trans ενδοκύτωσης υποδεικνύει την εμπλοκή μιας διαδικασίας μεταγωγής σήματος κατά τη διαδικασία ενδοκύτωσης από υπόστρωμα, ή τη χωροθετική σύναξη των μορίων του UapA σε μεμβρανικές υποδομές, ή τον ομοδιμερισμό-ομοολιγομερισμό τους. Για τη μελέτη της πιθανότητας χωροθετικής σύναξης των μορίων του UapA σε δομές υποοργάνωσης της πλασματικής μεμβράνης, μελετήθηκε η πιθανότητα εντοπισμού του μεταφορέα σε γνωστές τέτοιες περιπτώσεις, όπως τα εισοσώματα, παρόλο που ο ομοιόμορφος εντοπισμός του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη δεν υποστήριζε κάτι τέτοιο. Αντίστοιχα ομοιόμορφη όμως φάνηκε να είναι και η κατανομή της εργοστερόλης της πλασματικής μεμβράνης του μύκητα, μετά από χρώση με filipin. Έτσι, μελετήθηκε η ικανότητα εκχύλισης μορίων UapA από την πλασματική μεμβράνη παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων μη-ιονικών τασιενεργών και βρέθηκε πως ο UapA δε τοποθετείται σε περιοχές της μεμβράνης με ιδιαίτερη σύσταση ως προς τη συγκέντρωση εργοστερόλης. Από στη συγκεκριμένη εργασία τέθηκαν οι βάσεις για την πληρέστερη κατανόηση της ρυθμιζόμενης διακίνησης του UapA. Η εμπλοκή της HulA υποδεικνύει πως το είδος και ο υποκυτταρικός τόπος της ουβικουιτινυλίωσης πιθανώς ρυθμίζουν τη στόχευση του μεταφορέα. Επιπλέον αναγκαία φαίνεται η ύπαρξη πρωτεϊνών προσαρμοστών μεταξύ του UapA και της HulA, μιας και ο UapA, όπως όλοι οι μέχρι στιγμής μελετημένοι μεταφορείς, δεν διαθέτει γνωστές αλληλουχίες αναγνώρισης από την HulA. Το γεγονός πως διακριτά σήματα ενδοκύτωσης συγκλίνουν σε ουβικουιτινυλίωση από την ίδια λιγάση προτείνει την εμπλοκή διαφορετικών προσαρμοστικών μορίων. Η μελέτη της αλληλεπίδρασης του μεταφορέα με τα μόρια-προσαρμοστές θα ήταν καινοτόμος. Τέλος, το φαινόμενο της in trans ενδοκύτωσης αφήνει ανοικτό το ενδεχόμενο ολιγομερισμού του UapA και της πιθανής εμπλοκής της κατάστασης ολιγομερισμού του στην υποκυτταρική του στόχευση

On the Evolution of Specificity in Members of the Yeast Amino Acid Transporter Family as Parts of Specific Metabolic Pathways

In the recent years, molecular modeling and substrate docking, coupled with biochemical and genetic analyses have identified the substrate-binding residues of several amino acid transporters of the yeast amino acid transporter (YAT) family. These consist of (a) residues conserved across YATs that interact with the invariable part of amino acid substrates and (b) variable residues that interact with the side chain of the amino acid substrate and thus define specificity. Secondary structure sequence alignments showed that the positions of these residues are conserved across YATs and could thus be used to predict the specificity of YATs. Here, we discuss the potential of combining molecular modeling and structural alignments with intra-species phylogenetic comparisons of transporters, in order to predict the function of uncharacterized members of the family. We additionally define some orphan branches which include transporters with potentially novel, and to be characterized specificities. In addition, we discuss the particular case of the highly specific l-proline transporter, PrnB, of Aspergillus nidulans, whose gene is part of a cluster of genes required for the utilization of proline as a carbon and/or nitrogen source. This clustering correlates with transcriptional regulation of these genes, potentially leading to the efficient coordination of the uptake of externally provided l-Pro via PrnB and its enzymatic degradation in the cell

Comparative genomics reveals high biological diversity and specific adaptations in the industrially and medically important fungal genus Aspergillus

Background: The fungal genus Aspergillus is of critical importance to humankind. Species include those with industrial applications, important pathogens of humans, animals and crops, a source of potent carcinogenic contaminants of food, and an important genetic model. The genome sequences of eight aspergilli have already been explored to investigate aspects of fungal biology, raising questions about evolution and specialization within this genus. Results: We have generated genome sequences for ten novel, highly diverse Aspergillus species and compared these in detail to sister and more distant genera. Comparative studies of key aspects of fungal biology, including primary and secondary metabolism, stress response, biomass degradation, and signal transduction, revealed both conservation and diversity among the species. Observed genomic differences were validated with experimental studies. This revealed several highlights, such as the potential for sex in asexual species, organic acid production genes being a key feature of black aspergilli, alternative approaches for degrading plant biomass, and indications for the genetic basis of stress response. A genome-wide phylogenetic analysis demonstrated in detail the relationship of the newly genome sequenced species with other aspergilli. Conclusions: Many aspects of biological differences between fungal species cannot be explained by current knowledge obtained from genome sequences. The comparative genomics and experimental study, presented here, allows for the first time a genus-wide view of the biological diversity of the aspergilli and in many, but not all, cases linked genome differences to phenotype. Insights gained could be exploited for biotechnological and medical applications of fungi.0SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Conformation-regulated lateral segregation of the Can1 permease

Can1, the arginine permease of yeast, is dynamically localized in the Membrane Compartment occupied by Can1 (MCC), a plasma membrane microdomain associated with a cytoplasmic protein scaffold termed eisosome (1). Can1 undergoes ubiquitin (Ub)-dependent endocytosis in response to substrate transport (2). Yet the physiological significance of the enrichment of Can1 in the MCC with respect to its functionality and substrate-induced endocytosis remains controversial (3,4). We have now investigated the potential role of lipids and Ub in the lateral plasma membrane distribution of Can1. We found that the MCC enrichment of Can1 requires proper sphingolipid biosynthesis. In keeping with previous studies, addition of arginine promotes exit of Can1 from the MCCs. Our results show that this redistribution is dependent on Can1 activity but not on its ubiquitylation. Furthermore, an inactive Can1 mutant seems to adopt a conformation favoring its exit from the MCCs. Our data are consistent with a model where some conformational changes adopted by Can1 during substrate transport promote its segregation out of the MCCs, followed by its ubiquitylation and endocytosis.info:eu-repo/semantics/nonPublishe

Fungal plasma membrane domains.

The plasma membrane (PM) performs a plethora of physiological processes, the coordination of which requires spatial and temporal organization into specialized domains of different sizes, stability, protein/lipid composition and overall architecture. Compartmentalization of the PM has been particularly well studied in the yeast Saccharomyces cerevisiae, where five non-overlapping domains have been described: The Membrane Compartments containing the arginine permease Can1 (MCC), the H+-ATPase Pma1 (MCP), the TORC2 kinase (MCT), the sterol transporters Ltc3/4 (MCL), and the cell wall stress mechanosensor Wsc1 (MCW). Additional cortical foci at the fungal PM are the sites where clathrin-dependent endocytosis occurs, the sites where the external pH sensing complex PAL/Rim localizes, and sterol-rich domains found in apically grown regions of fungal membranes. In this review, we summarize knowledge from several fungal species regarding the organization of the lateral PM segregation. We discuss the mechanisms of formation of these domains, and the mechanisms of partitioning of proteins there. Finally, we discuss the physiological roles of the best-known membrane compartments, including the regulation of membrane and cell wall homeostasis, apical growth of fungal cells and the newly emerging role of MCCs as starvation-protective membrane domains.info:eu-repo/semantics/publishe

Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis

The plasma membrane is implicated in a variety of functions, whose coordination necessitates highly dynamic organization of its constituents into domains of distinct protein and lipid composition. Eisosomes, at least partially, mediate this lateral plasma membrane compartmentalization. In this work, we show that the Nce102 homologue of Aspergillus nidulans colocalizes with eisosomes and plays a crucial role in density/number of PilA/SurG foci in the head of germlings. In addition we demonstrate that AnNce102 and PilA negatively regulate sphingolipid biosynthesis, since their deletions partially suppress the thermosensitivity of basA mutant encoding sphingolipid C4-hydroxylase and the growth defects observed upon treatment with inhibitors of sphingolipid biosynthesis, myriocin and Aureobasidin A. Moreover, we show that YpkA repression mimics genetic or pharmacological depletion of sphingolipids, conditions that induce the production of Reactive Oxygen Species (ROS), and can be partially overcome by deletion of pilA and/or annce102 at high temperatures. Consistent with these findings, pilA " and annce102 " also show differential sensitivity to various oxidative agents, while AnNce102 overexpression can bypass sphingolipid depletion regarding the PilA/SurG foci number and organization, also leading to the mislocalization of PilA to septa.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Function and Regulation of Fungal Amino Acid Transporters: Insights from Predicted Structure

info:eu-repo/semantics/publishe

Overlapping Roles of Yeast Transporters Aqr1, Qdr2, and Qdr3 in Amino Acid Excretion and Cross-Feeding of Lactic Acid Bacteria.

Microbial species occupying the same ecological niche or codeveloping during a fermentation process can exchange metabolites and mutualistically influence each other's metabolic states. For instance, yeast can excrete amino acids, thereby cross-feeding lactic acid bacteria unable to grow without an external amino acid supply. The yeast membrane transporters involved in amino acid excretion remain poorly known. Using a yeast mutant overproducing and excreting threonine (Thr) and its precursor homoserine (Hom), we show that excretion of both amino acids involves the Aqr1, Qdr2, and Qdr3 proteins of the Drug H+-Antiporter Family (DHA1) family. We further investigated Aqr1 as a representative of these closely related amino acid exporters. In particular, structural modeling and molecular docking coupled to mutagenesis experiments and excretion assays enabled us to identify residues in the Aqr1 substrate-binding pocket that are crucial for Thr and/or Hom export. We then co-cultivated yeast and Lactobacillus fermentum in an amino-acid-free medium and found a yeast mutant lacking Aqr1, Qdr2, and Qdr3 to display a reduced ability to sustain the growth of this lactic acid bacterium, a phenotype not observed with strains lacking only one of these transporters. This study highlights the importance of yeast DHA1 transporters in amino acid excretion and mutualistic interaction with lactic acid bacteria.info:eu-repo/semantics/publishe