Characterization of the cytoskeleton organization in cancerous cells

Zdolność nowotworów do migracji i tworzenia przerzutów jest związana z odmiennym różnicowaniem się komórek nowotworowych. Na podstawie wielu doniesień literaturowych wiadomo, że organizacja cytoszkieletu ulega zmianie podczas progresji nowotworu. W szczególności, obserwowane są zmiany ilości i rozkładu filamentów aktynowych, jednego z elementów cytoszkieletu. Celem eksperymentów przedstawionych w tej pracy była charakterystyka struktury cytoszkieletu komórek nowotworowych oraz powiązanie różnic w jego organizacji z własnościami elastycznymi komórek. Badaniom poddano 2 linie komórkowe nabłonka przewodu i pęcherza moczowego: HCV29 wywodzącą się z nabłonka przewodu moczowego (niezłośliwy rak) i T24 – linię pochodząca ze raka przejściowokomórkowego nabłonka pęcherza moczowego (o dużym stopniu inwazyjności); oraz 2 linie czerniaka pochodzące z pierwotnego ogniska nowotworu (linia WM115) oraz z przerzutu do skóry (WM266-4 o dużym stopniu inwazyjności).Analizę jakościową rozkładu elementów cytoszkieletu komórek przeprowadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii sił atomowych. Mikroskop sił atomowych dzięki przystosowaniu do pomiarów w cieczy oferuje nie tylko możliwość pomiaru topografii żywych komórek z bardzo dobrą zdolnością rozdzielczą, ale również, pracując w trybie spektroskopii sił, pozwala na wyznaczenie ich własności elastycznych. Dzięki temu, na podstawie pomiarów spektroskopowych wyznaczono rozkłady wartości modułu elastyczności (tj. modułu Young'a) w funkcji głębokości ugięcia próbki (tzw. indentacji) dla każdej z linii komórkowych.Rezultatem pracy jest wykazanie, że zmiany w organizacji i budowie mikrofilamentów są związane ze progresją nowotworową raka pęcherza moczowego i czerniaka. Komórki rakowe o charakterze inwazyjnym (T24 i WM266-4) posiadały zaburzoną strukturę cytoszkieletu związaną ze zmianą ich właściwości elastycznych, prowadzących do ich większej deformowalności (mają niższe średnie wartości modułu Young'a) niż komórki pochodzące ze stadium raka przedinwazyjnego. Ponadto udowodniono hipotezę, że dla małych wartości indentacji rozkłady modułu Young'a niosą informację o lokalnej organizacji cytoszkieletu komórki podczas gdy większe wartości indentacji zawierają odpowiedź pochodzącą z całej objętości komórki.Cancerous cell aptitude for invasion and migration has been associated with poor differentiation of the cell, including its cytoskeleton. There are evidences, based on numeous literature data, showing alterations of cytoskeleton structure during cancer progression. In particular, differencers in the amount and distribution of actin filaments, one of the structural elements of cytoskeleton, has been already reported.The main aim of the presented work was the characterization of cytoskeleton organization in search of relations with mechanical properties of cancerous cells. Therefore, four different cell lines originating from various stages of cancer progression and distinct cancers have been studied. There were human bladder cancer cells (HCV29 and T24) and human melanoma (WM115 and WM266-4). The differences between microfilaments organization in the studied cell’s cytoskeleton have been qualitatively assessed using fluorescent and atomic force microscopies. Especially, the atomic force microscope offers not only the measurements of cell surface with high resolution but also it enables the quantification of cell’s elastic properties. Thanks to this microscope’s feasibility, the distributions of elastic modulus (i.e. Young’a modulus) as a function of indentation depth were created for each studied cell type. The main result of studies shows that changes observed upon cancer progression are correlated with the alterations of elastic properties in bladder cancer and melanoma. Cancerous cells (T24 and WM266-4) posseses impaired cytoskeletal structure linked with their higher deformability as compared to cells from non-invasive stages of cancer (HCV29 and WM115). Moreover, the force spectroscopy data delivers evidences that the Young's modulus distribution in case of small indentations reveals local organization f cytoskeleton while larger indentations depths include mechanical response originating from a whole cell body

Differentiation between single bladder cancer cells using principal component analysis of time-of-flight secondary ion mass spectrometry

Time-of-flight-secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS) mass spectra measurements combined with an appropriate sample preparation protocol are the powerful tools to obtain unique information about the chemical composition of biological materials. In our studies, two questions were addressed, i.e., whether it is possible to develop a fixative-based sample preparation protocol and whether it allows one to distinguish between cells originating from various stages of cancer progression. Therefore, four human bladder cancer cell lines (with distinct malignancy degree) have been investigated. A chemical fixation protocol has been used for TOF-SIMS measurements, and mass spectra were obtained using a Bi_{3}+ primary ion beam. The principal component analysis (PCA) has been applied to analyze the whole range of mass spectra (without preselection of any particular masses) using two approaches of data preprocessing, namely, mean centering and autoscaling. The PC3 versus PC2 plot has showed significant differences between nonmalignant cancer cells and the cancerous ones for both of preprocessing approaches. The analysis of mass spectra of human bladder cells allows one to find a list of mass peaks with intensities significantly larger in cancerous bladder cells compared to nonmalignant cell cancer of the ureter (HCV29 cells). These findings show that TOF-SIMS in combination with PCA can be used to identify reference, human bladder cells from cancerous ones