Characterization of the audiogenic mutant mice tremor as a new model of epilepsy: evaluation of neurotransmitters and proinflammatory citokynes in hippocampus

O camundongo mutante espontâneo tremor (tr) foi identificado no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. A mutação foi assim denominada pois a primeira característica fenotípica aparente dos animais foi o tremor ao se movimentarem. A mutação, autossômica recessiva, foi inicialmente observada em camundongos Swiss, e mais tarde, por meio de dez retrocruzamentos, foi transferida para a linhagem congênica C57BL/6 (N10), pois isso possibilitaria o mapeamento genético para encontrar a mutação. Além do tremor a característica mais marcante desses mutantes foi a presença de convulsões clônicas de origem audiogênica, crises reflexas que se encaixam no diagnóstico de epilepsia, fazendo com que esses camundongos sejam considerados um novo modelo animal para o estudo desta disfunção. Para aprimorar a caracterização do mutante tremor foram estudadas suas respostas em testes comportamentais e o seu desenvolvimento pós-natal físico e de reflexos. Com os resultados do desenvolvimento pós-natal identificou-se que os mutantes tremor apresentaram alterações, como incoordenação motora e diminuição das respostas similares as de ansiedade, somente após o desmame, ou seja na terceira semana de vida. Resultados preliminares do mapeamento genético utilizando marcadores microssatélites distribuídos pelo genoma do camundongo, indicaram que a mutação se encontraria no cromossomo 14, na região entre 33,21 e 38,21cM, tendo como gene candidato mais provável o Egr3; entretanto, o sequenciamento realizado pelo método Sanger não apresentou alterações quando comparado aos camundongos controle (Wild Type WT). Para a caracterização das crises epilépticas os camundongos foram expostos à estímulo acústico com frequência de 20kHz, apresentando convulsão audiogênica clônica generalizada. Trinta minutos após a convulsão a expressão de RNA mensageiro (mRNA) do gene candidato Egr3 e dos genes Gabra1 e Gabra 4, descritos na literatura como relacionados ao surgimento e ao desenvolvimento de convulsões, foi quantificada no hipocampo por qRT-PCR. Foi quantificada também a expressão das citocinas pró-inflamatórias Tnf-α, Il-1β, Il-6, Ccl2 e Ccl3. Os neurotransmissores, e seus metabólitos, que são considerados importantes para o desenvolvimento e controle das crises epilépticas foram quantificados por HPLC, sendo eles: ácido γ-amino butírico (GABA), glutamato (GLU), glicina (GLY), aspartato (ASP), dopamina (DA), ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanilico (HVA), noradrenalina (NOR) ácido vanilmandélico (VMA), serotonina (5-HT) e ácido 5 hidroxi indol acético (5HIAA). Quando comparados aos camundongos WT os mutantestremor apresentaram aumento na concentração de GABA, GLU, ASP, NOR e neurotransmissores da via serotoninérgica e diminuição dos níveis de HVA e de GLY no hipocampo. Em relação à expressão gênica, observou-se superexpressão de ll-1β e Ccl3 no hipocampo dos camundongos tremor naive, com diminuição significativa 30 minutos após a convulsão. Ao contrário, a expressão de Gabra1 e Gabra4 que se encontrava diminuída no hipocampo dos camundongos tremor naive, aumentou após a convulsão. Esses resultados indicaram que os genes Egr3, Gabra 1 e 4 e as citocinas ll-1β e Ccl3 estão envolvidos no mecanismo de surgimento e desenvolvimentos das convulsões no mutante tremor, que pode ser caracterizado como um novo modelo animal para estudo de epilepsia.The spontaneous mutant mice tremor (tr) was identified in the animal facility of the Department of Pathology from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade de São Paulo. The mutation was named tremor because the first phenotypic characteristic seen in these mice was the tremor when moving. This autossomal recessive mutation was firstly observed in Swiss mice, and then transferred to C57BL/6 by ten backcrosses (N10), as this would allow genetic mapping to find the mutation. Besides tremor, the most important characteristic of this mutant is the presence of audiogenic tonic seizures, that are reflex seizures that fits the epilepsy diagnostic, making these mice a new animal model to study or this disease. To improve behavioral characterization of mutant tremor, their results in behavior tests were analyzed along their postnatal physical and reflexology development. Postnatal development analysis made possible to identify that mutant tremor presents changes, such as motor impairment and decreased anxiety-like responses, only after third week of life, at the weaning. Primary results of genetic mapping using microsatellite markers distributed by the mouse genome, indicated that the mutation is in chromosome 14 (between 33.21 and 38.21cM), making Egr3 an important candidate gene, even though the sequencing performed by Sanger method of tremor sample did not show differences when compared to wild type (WT) mice. Regarding the characterization of epileptic seizures mice were exposed to a sound stimulus at a frequency of 20kHz, presenting audiogenic clonic seizures. Thirty minutes after seizure the expression of mRNA of candidate gene (Egr3) and other important genes (Gabra1 and 4), known in literature to be important in epileptogenesis, were quantified in hippocampus by real time PCR (qRT-PCR). Proinflammatory cytokines (Tnf-α, Il-1β, Il-6, Ccl2 e Ccl3) expression. were quantified. Neurotransmitters, and it metabolites, that are also considered important for epileptogenesis and it epilepsy control were quantified by HPLC, such as γ- amino butyric acid (GABA), glutamate (GLU), glycine (GLY), aspartate (ASP), dopamine (DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanillic acid (HVA), noradrenalin (NOR), vanilliylmandelic acid (VMA), serotonin (5-HT) and 5- Hydroxyindoleacetic acid (5HIAA). Comparing to WT mice, tremor presented raised levels of GABA, GLU, ASP, NOR and neurotransmitters of seroroninergic pathways, and decrased levels HVA and GLY in hippocampus. Considering gene expression, an overexpression of ll-1β and Ccl3 was observed in hippocampus of naive mice, and a significant decrease thirdy minutes after seizures. On the other hand, decreased expression of Gabra 1 and 4 found in hippocampus of naive mice raised after seizure. These results showed that genes Egr3, Gabra 1 and 4 and cytokines ll- 1β and Ccl3 are involved in epileptogenesis of mutant tremor, which can be characterized as a new model to study epilepsy

Phenotypic Caracterization of spontaneous mutant mice tremor using behavioral test batteries

A mutação espontânea tremor (tr) , autossômica recessiva, foi identificada na colônia de camundongos Swiss no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os mutantes apresentaram como principais características fenotípicas tremores, ataxia e convulsões tônicas audiogênicas. Por meio de dez retrocruzamentos essa mutação foi transferida para a linhagem congênica C57BL/6 (N10). O mapeamento genético com marcadores microssatélites distribuídos pelo genoma do camundongo indicou que a mutação tr encontra-se no cromossomo 14, na região entre 33,21 e 38,21 cM, tendo como possível candidato o gene Egr3 (Early Growth Response 3). O presente estudo teve como objetivo caracterizar o fenótipo comportamental do camundongo mutante tremor. A caracterização do fenótipo dos camundongos mutantes Swiss foi realizada a partir do nascimento até a idade adulta. Os parâmetros do desenvolvimento físico analisados foram: desdobramento das orelhas, erupção dos dentes incisivos, abertura dos olhos, surgimento da pelagem completa, ganho de peso e comprimento dos filhotes e desenvolvimento sexual. No desenvolvimento reflexológico foram analisados: preensão palmar, geotaxia negativa, endireitamento de postura e sobressalto. No 21&ordem; dia de vida foi realizado o teste de campo aberto para analisar a atividade geral dos animais, e no 60&ordem; dia esse teste foi repetido, juntamente com testes para analisar parâmetros comportamentais. Os testes realizados em campo aberto foram ordenados por parâmetro avaliado; 1) atividade geral dos animais e sistema sensorial: frêmito vocal, irritabilidade, reflexo auricular, aperto de cauda, reflexo corneal e resposta ao toque; 2) testes psicomotores: trem posterior, reflexo de endireitamento, tônus corporal e força de agarrar; 3) avaliação do sistema nervoso central: tremores, cauda em pé, micção e defecação. Demais testes realizados analisaram: comportamento em labirinto em cruz elevada, coordenação motora em trave elevada, memória espacial no labirinto em T, e respostas comportamentais nos testes de natação forçada e de suspensão pela cauda. Exceto pelo menor peso no desmame, os parâmetros de desenvolvimento analisados não apresentaram diferenças significativas entre os mutantes e controles, o que confirmou a hipótese de que as alterações fenotípicas somente são perceptíveis a partir de 3 semanas de vida. A caracterização comportamental do fenótipo também foi realizada nos mutantes em fundo genético C57BL/6, de ambos os sexos, com 8 semanas de idade. Em relação aos camundongos controle, nos mutantes houve aumento da presença de cauda em pé, da ataxia e do tremor; menor frequência de levantar e de limpeza do corpo (grooming); redução da coordenação motora, indicando evidente prejuízo motor. Também foram observadas respostas negativas à ansiedade e hiperatividade, mas não houve alteração na memória espacial dos mutantes. Os resultados indicaram que o mutante tremor apresentou prejuízos de origem no sistema nervoso central; demostraram também que o fenótipo observado coincide com as alterações descritas na literatura, sugerindo o gene Egr3 como possível candidato para a mutação. A caracterização fenotípica desse animal é importante no entendimento das alterações causadas pela mutação e se essa apresenta potencial como modelo para doenças neurológicas.The autosomal recessive spontaneous mutation tremor (tr) was identified in the Swiss mice colony of the laboratory animal facility of the Department of Pathology, from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo. The mutants presented tremors, ataxia and audiogenic tonic convulsions as the main expressive characteristics. This mutation was moved from Swiss onto C57BL/6 by ten backcrosses (N10). Genetic mapping with microsatellite markers distributed through the mouse genome showed that the mutation is on 14 chromosome, between 33.21 and 38.21 cM, making Egr3 (Early Growth Response 3) a candidate gene. This study aimed to characterize the behavior phenotype of the tremor mice. Phenotypic characterization of the Swiss mutant mice was performed from birth to adulthood. The physical development points analyzed were: unfolding of the ears, eruption of the incisor teeth, opening the eyes, complete fur, weight gain and length, and sexual development. The reflexology development ones were: palmar grip, negative geotaxia, posture straightening and reaction to sound. On the 21day-old the open field test was performed to analyze the activity of the animals, and on the 60-day-old this task was repeated along with tests to analyze behavioral parameters. The tests performed in the open field were evaluated by parameters; 1) general activity and sensory system: vocalization, irritability, auricular reflex, tail flick, corneal reflex and response to touch; 2) psychomotor tests: hindquarter fall, surface-rightingreflex, body tone and grasping strength; 3) evaluation of the central nervous system: tremors, straub tail, micturitionand defecation. Other tests analyzed: behavior in elevated plus maze, motor coordination in balance beam test, spatial memory in T maze alternation test, and behavioral responses in forced swing and tail suspension tests. Except for the lower weight at weaning, the development parameters analyzed did not show significant differences between the mutants and controls, which confirmed the hypothesis that phenotypic changes are only perceptible after 3weeks-old. The behavioral characterization of the phenotype was also performed on 8-week-old C57BL/6 mutants of both sexes. In comparison to the control mice, in the mutants there were an increase in the presence of straub tail, ataxia and tremor; less frequent rearing and grooming; less motor coordination, indicating evident motor impairment. Negative responses to anxiety and hyperactivity were also observed, but there was no change in the spatial memory of the mutants. The results indicated that the tremor mutant presented damages in the central nervous system; also showed that the phenotype coincides with the changes described in the literature, suggesting the Egr3 gene as a possible candidate for the mutation. The phenotypic characterization of this animal is important to clarify impairments caused by the genetic mutation, and also identify if this potential model could be useful to study neurological diseases

Phenotypic Caracterization of spontaneous mutant mice tremor using behavioral test batteries

A mutação espontânea tremor (tr) , autossômica recessiva, foi identificada na colônia de camundongos Swiss no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os mutantes apresentaram como principais características fenotípicas tremores, ataxia e convulsões tônicas audiogênicas. Por meio de dez retrocruzamentos essa mutação foi transferida para a linhagem congênica C57BL/6 (N10). O mapeamento genético com marcadores microssatélites distribuídos pelo genoma do camundongo indicou que a mutação tr encontra-se no cromossomo 14, na região entre 33,21 e 38,21 cM, tendo como possível candidato o gene Egr3 (Early Growth Response 3). O presente estudo teve como objetivo caracterizar o fenótipo comportamental do camundongo mutante tremor. A caracterização do fenótipo dos camundongos mutantes Swiss foi realizada a partir do nascimento até a idade adulta. Os parâmetros do desenvolvimento físico analisados foram: desdobramento das orelhas, erupção dos dentes incisivos, abertura dos olhos, surgimento da pelagem completa, ganho de peso e comprimento dos filhotes e desenvolvimento sexual. No desenvolvimento reflexológico foram analisados: preensão palmar, geotaxia negativa, endireitamento de postura e sobressalto. No 21&ordem; dia de vida foi realizado o teste de campo aberto para analisar a atividade geral dos animais, e no 60&ordem; dia esse teste foi repetido, juntamente com testes para analisar parâmetros comportamentais. Os testes realizados em campo aberto foram ordenados por parâmetro avaliado; 1) atividade geral dos animais e sistema sensorial: frêmito vocal, irritabilidade, reflexo auricular, aperto de cauda, reflexo corneal e resposta ao toque; 2) testes psicomotores: trem posterior, reflexo de endireitamento, tônus corporal e força de agarrar; 3) avaliação do sistema nervoso central: tremores, cauda em pé, micção e defecação. Demais testes realizados analisaram: comportamento em labirinto em cruz elevada, coordenação motora em trave elevada, memória espacial no labirinto em T, e respostas comportamentais nos testes de natação forçada e de suspensão pela cauda. Exceto pelo menor peso no desmame, os parâmetros de desenvolvimento analisados não apresentaram diferenças significativas entre os mutantes e controles, o que confirmou a hipótese de que as alterações fenotípicas somente são perceptíveis a partir de 3 semanas de vida. A caracterização comportamental do fenótipo também foi realizada nos mutantes em fundo genético C57BL/6, de ambos os sexos, com 8 semanas de idade. Em relação aos camundongos controle, nos mutantes houve aumento da presença de cauda em pé, da ataxia e do tremor; menor frequência de levantar e de limpeza do corpo (grooming); redução da coordenação motora, indicando evidente prejuízo motor. Também foram observadas respostas negativas à ansiedade e hiperatividade, mas não houve alteração na memória espacial dos mutantes. Os resultados indicaram que o mutante tremor apresentou prejuízos de origem no sistema nervoso central; demostraram também que o fenótipo observado coincide com as alterações descritas na literatura, sugerindo o gene Egr3 como possível candidato para a mutação. A caracterização fenotípica desse animal é importante no entendimento das alterações causadas pela mutação e se essa apresenta potencial como modelo para doenças neurológicas.The autosomal recessive spontaneous mutation tremor (tr) was identified in the Swiss mice colony of the laboratory animal facility of the Department of Pathology, from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo. The mutants presented tremors, ataxia and audiogenic tonic convulsions as the main expressive characteristics. This mutation was moved from Swiss onto C57BL/6 by ten backcrosses (N10). Genetic mapping with microsatellite markers distributed through the mouse genome showed that the mutation is on 14 chromosome, between 33.21 and 38.21 cM, making Egr3 (Early Growth Response 3) a candidate gene. This study aimed to characterize the behavior phenotype of the tremor mice. Phenotypic characterization of the Swiss mutant mice was performed from birth to adulthood. The physical development points analyzed were: unfolding of the ears, eruption of the incisor teeth, opening the eyes, complete fur, weight gain and length, and sexual development. The reflexology development ones were: palmar grip, negative geotaxia, posture straightening and reaction to sound. On the 21day-old the open field test was performed to analyze the activity of the animals, and on the 60-day-old this task was repeated along with tests to analyze behavioral parameters. The tests performed in the open field were evaluated by parameters; 1) general activity and sensory system: vocalization, irritability, auricular reflex, tail flick, corneal reflex and response to touch; 2) psychomotor tests: hindquarter fall, surface-rightingreflex, body tone and grasping strength; 3) evaluation of the central nervous system: tremors, straub tail, micturitionand defecation. Other tests analyzed: behavior in elevated plus maze, motor coordination in balance beam test, spatial memory in T maze alternation test, and behavioral responses in forced swing and tail suspension tests. Except for the lower weight at weaning, the development parameters analyzed did not show significant differences between the mutants and controls, which confirmed the hypothesis that phenotypic changes are only perceptible after 3weeks-old. The behavioral characterization of the phenotype was also performed on 8-week-old C57BL/6 mutants of both sexes. In comparison to the control mice, in the mutants there were an increase in the presence of straub tail, ataxia and tremor; less frequent rearing and grooming; less motor coordination, indicating evident motor impairment. Negative responses to anxiety and hyperactivity were also observed, but there was no change in the spatial memory of the mutants. The results indicated that the tremor mutant presented damages in the central nervous system; also showed that the phenotype coincides with the changes described in the literature, suggesting the Egr3 gene as a possible candidate for the mutation. The phenotypic characterization of this animal is important to clarify impairments caused by the genetic mutation, and also identify if this potential model could be useful to study neurological diseases

Brazilian Flora 2020: Leveraging the power of a collaborative scientific network

International audienceThe shortage of reliable primary taxonomic data limits the description of biological taxa and the understanding of biodiversity patterns and processes, complicating biogeographical, ecological, and evolutionary studies. This deficit creates a significant taxonomic impediment to biodiversity research and conservation planning. The taxonomic impediment and the biodiversity crisis are widely recognized, highlighting the urgent need for reliable taxonomic data. Over the past decade, numerous countries worldwide have devoted considerable effort to Target 1 of the Global Strategy for Plant Conservation (GSPC), which called for the preparation of a working list of all known plant species by 2010 and an online world Flora by 2020. Brazil is a megadiverse country, home to more of the world's known plant species than any other country. Despite that, Flora Brasiliensis, concluded in 1906, was the last comprehensive treatment of the Brazilian flora. The lack of accurate estimates of the number of species of algae, fungi, and plants occurring in Brazil contributes to the prevailing taxonomic impediment and delays progress towards the GSPC targets. Over the past 12 years, a legion of taxonomists motivated to meet Target 1 of the GSPC, worked together to gather and integrate knowledge on the algal, plant, and fungal diversity of Brazil. Overall, a team of about 980 taxonomists joined efforts in a highly collaborative project that used cybertaxonomy to prepare an updated Flora of Brazil, showing the power of scientific collaboration to reach ambitious goals. This paper presents an overview of the Brazilian Flora 2020 and provides taxonomic and spatial updates on the algae, fungi, and plants found in one of the world's most biodiverse countries. We further identify collection gaps and summarize future goals that extend beyond 2020. Our results show that Brazil is home to 46,975 native species of algae, fungi, and plants, of which 19,669 are endemic to the country. The data compiled to date suggests that the Atlantic Rainforest might be the most diverse Brazilian domain for all plant groups except gymnosperms, which are most diverse in the Amazon. However, scientific knowledge of Brazilian diversity is still unequally distributed, with the Atlantic Rainforest and the Cerrado being the most intensively sampled and studied biomes in the country. In times of “scientific reductionism”, with botanical and mycological sciences suffering pervasive depreciation in recent decades, the first online Flora of Brazil 2020 significantly enhanced the quality and quantity of taxonomic data available for algae, fungi, and plants from Brazil. This project also made all the information freely available online, providing a firm foundation for future research and for the management, conservation, and sustainable use of the Brazilian funga and flora

Growing knowledge: an overview of Seed Plant diversity in Brazil

Abstract An updated inventory of Brazilian seed plants is presented and offers important insights into the country's biodiversity. This work started in 2010, with the publication of the Plants and Fungi Catalogue, and has been updated since by more than 430 specialists working online. Brazil is home to 32,086 native Angiosperms and 23 native Gymnosperms, showing an increase of 3% in its species richness in relation to 2010. The Amazon Rainforest is the richest Brazilian biome for Gymnosperms, while the Atlantic Rainforest is the richest one for Angiosperms. There was a considerable increment in the number of species and endemism rates for biomes, except for the Amazon that showed a decrease of 2.5% of recorded endemics. However, well over half of Brazillian seed plant species (57.4%) is endemic to this territory. The proportion of life-forms varies among different biomes: trees are more expressive in the Amazon and Atlantic Rainforest biomes while herbs predominate in the Pampa, and lianas are more expressive in the Amazon, Atlantic Rainforest, and Pantanal. This compilation serves not only to quantify Brazilian biodiversity, but also to highlight areas where there information is lacking and to provide a framework for the challenge faced in conserving Brazil's unique and diverse flora