Generierung eines Mausmodells für „ICE-Fieber“

Fragestellung: Um die Auswirkungen von genetischen Varianten für CASP1 in vivo analysieren zu können, sollte in dieser Arbeit ein Tiermodell generiert werden. Dadurch könnten die zugrundeliegenden Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten in einem gesamten Organismus aufgeklärt werden, da die Untersuchung von Patientenmaterial nur sehr eingeschränkt möglich ist. Ein Mausmodell stellt eine der besten Alternativen zur Analyse von Primärmaterial dar, da die Immunsysteme von Maus und Mensch sehr ähnlich sind. Ergebnisse: Um die natürliche Expression und Regulation der Procaspase-1 im Mausmodell zu gewährleisten, wurde für die Generierung ein BAC-Transgen verwendet. Mittels homologer Rekombination wurde die künstliche Variante C284A von Casp1 inseriert. Diese führt zu einer Zerstörung des enzymatischen Zentrums der Caspase-1 und zum vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Nach zwei Pronukleusinjektionen konnten lediglich drei Gründertiere mit mosaikartiger Expression des zufällig im Genom integrierten Transgens Casp1C284A und in der F1-Generation nur ein Tier mit stabil integriertem Transgen identifiziert werden. Die Nachkommen dieses transgenen Tieres zeigten keine basale Expression von Casp1C284A, jedoch konnte nach Stimulation von BMDCs mit LPS in vitro die Expression sowohl auf RNA- wie auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Ebenfalls eine erhöhte Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 wurde in den Zellen der transgenen Tiere detektiert. Gleichfalls konnte nach Stimulation mit LPS in vivo eine gesteigerte Entzündungsreaktion in den Tieren mit Casp1C284A gezeigt werden, da ein stärkerer und länger anhaltender Abfall der peripheren Körpertemperatur und außerdem eine gesteigerte Sekretion von TNF-α und IL-6 zu verzeichnen war. Eine gesteigerte Inflammation des fetalen Gewebes, ausgelöst durch die integrierte künstliche Variante der Procaspase-1, könnte die Frage nach der geringen Anzahl der generierten Gründertiere beantworten. Hierfür wurde weiterführend eine Maus mit einem konditionalen Casp1C284A-Konstrukts generiert, welches zusätzlich eine zeit- als auch zelltyp-spezifische Expression der Procaspase-1 mit zentraler Mutation ermöglicht. Nach erfolgreichem Screening der ES-Zellen konnten diese in Blastozysten mikroinjiziert und Chimäre identifiziert werden. Eine embryonale Letalität des transgenen Konstrukts konnte durch die Verpaarung der ki-Tiere R26_Casp1C284A mit PGK-Cre-Tieren, die Cre-Rekombinase ubiquitär exprimieren, nahezu ausgeschlossen werden, da die Nachkommen alle lebensfähig waren und eine basale Expression des „knock-ins“ in mehreren Organen und auch in BMDCs nachgewiesen wurde. Ferner konnte nach Induktion einer Inflammation in vivo mit einer subletalen Dosis von LPS ein gesteigerter und länger anhaltender peripherer Temperaturabfall in den ki-Tieren ähnlich zu den transgenen Tieren detektiert werden. Desgleichen wurde eine Tendenz zu einer gesteigerten Sekretion der Zytokine TNF-α und IL-6 verzeichnet. Schlussfolgerungen: Mit dem transgenen Casp1C284A-Mausmodell als auch mit dem konditionalen R26_Casp1C284A-Modell konnte gezeigt weren, dass eine inaktive Variante der Procaspase-1 zur Entstehung einer gesteigerten Inflammation in einem gesamten Organismus führen kann. Somit können die im Rahmen dieser Arbeit generierten Tiermodelle zur Analyse der Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten herangezogen werden. In künftigen Studien kann ferner geklärt werden, ob die Entzündungsreaktionen durch eine verstärkte Interaktion von Casp1C284A mit der Kinase RIP2 verursacht werden und dadurch ähnlich wie im Patienten eine Aktivierung des proinflammatorischen Moleküls NFκB ausgelöst wird. Im Anschluss könnte eine spezifische Inhibierung des RIP2-Signalweges in diesen Mausmodellen getestet werden und schließlich im Patienten Anwendung finden. Die in dieser Arbeit generierten Mausmodelle könnten somit zur Erprobung zukünftiger therapeutischer Konzepte dienen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. TabellenverzeichnisProblem: In order to recapitulate the effects of the CASP1 variants found in the patients a mouse model should be generated. The analysis of material from the patients unfortunately is very restricted and therefore the generation of a mouse model represents the best alternative to see if the in vitro hypothesis of the IFG group really applies to an in vivo situation. Results: To generate a transgenic mouse model the artificial variant Casp1C284A was inserted into a BAC to enable a natural expression and regulation of Casp1C284A. This mutation results in a disruption of the active centre and to a complete loss of the enzymatical activity of caspase-1. After two pronuclei injections we received 180 pubs of TG mice. Only three of them harboured transgenic sequences and only one animal in the F1 generation harboured the complete Casp1C284A sequence. Expression analyses of the offspring of this mouse revealed no basal transcriptional expression of the transgene. Hence, protein expression could not be detected in unstimulated cells. However, stimulation with LPS upregulated transcription and low-level translation of Casp1C284A in BMDCs and an elevated secretion of the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 was detected as well. Likewise, after in vivo stimulation of transgenic mice with LPS i.p. the drop of body temperature was significantly enhanced in comparison to the control mice. And also the level of the proinflammatory cytokines was increased. Furthermore, a conditional R26_Casp1C284A construct allowing a temporal or a celltype specific expression of the caspase-1 with the central mutation was generated. Positive screened ES cell clones were injected into blastocysts and thereafter chimera could be identified. An embryonic lethality due to the integration of the enzymatically inactive caspase-1 could be excluded by the crossing with ubiquitious expressing PGK-Cre mice. All the corresponding mice were alive and a basal transcriptional as well translational expression was demonstrated. Concordantly with the results of the transgenic mice the conditional R26_Casp1C284A mice showed an enhanced drop of the body temperature in comparison to control mice after stimulation with sublethal dose of LPS in vivo. Likewise, a trend to an elevated secretion of TNF-α and IL-6 was observed. Conclusion: With the generated transgenic Casp1C284A as well as the conditional R26_Casp1C284A animal models we showed that an inactive variant of the procaspase-1 could result in a proinflammatory cytokine response and a development of an increased inflammation of a whole organism. Thus, these data support the previous postulated model of the IFG group for proinflammatory effects induced by variants of procaspase-1 with reduced enzymatic activity. Hence, the mouse models established in this work are suited for further analysis of the pathomechanism in the patients with ICE fever. For instance the cellular mechanism could be examined if the inflammation is provoked by an increased interaction of the mutated procaspase-1 with the kinase RIP2 and therefore the NFκB activation is increased, respectively. Also a further medicinal inhibition of the RIP2 signaling or other therapeutic testings in this mouse models are conceivable.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichni

Lack of astrocytes hinders parenchymal oligodendrocyte precursor cells from reaching a myelinating state in osmolyte-induced demyelination

Demyelinated lesions in human pons observed after osmotic shifts in serum have been referred to as central pontine myelinolysis (CPM). Astrocytic damage, which is prominent in neuroinflammatory diseases like neuromyelitis optica (NMO) and multiple sclerosis (MS), is considered the primary event during formation of CPM lesions. Although more data on the effects of astrocyte-derived factors on oligodendrocyte precursor cells (OPCs) and remyelination are emerging, still little is known about remyelination of lesions with primary astrocytic loss. In autopsy tissue from patients with CPM as well as in an experimental model, we were able to characterize OPC activation and differentiation. Injections of the thymidine-analogue BrdU traced the maturation of OPCs activated in early astrocyte-depleted lesions. We observed rapid activation of the parenchymal NG2+ OPC reservoir in experimental astrocyte-depleted demyelinated lesions, leading to extensive OPC proliferation. One week after lesion initiation, most parenchyma-derived OPCs expressed breast carcinoma amplified sequence-1 (BCAS1), indicating the transition into a pre-myelinating state. Cells derived from this early parenchymal response often presented a dysfunctional morphology with condensed cytoplasm and few extending processes, and were only sparsely detected among myelin-producing or mature oligodendrocytes. Correspondingly, early stages of human CPM lesions also showed reduced astrocyte numbers and non-myelinating BCAS1+ oligodendrocytes with dysfunctional morphology. In the rat model, neural stem cells (NSCs) located in the subventricular zone (SVZ) were activated while the lesion was already partially repopulated with OPCs, giving rise to nestin+ progenitors that generated oligodendroglial lineage cells in the lesion, which was successively repopulated with astrocytes and remyelinated. These nestin+ stem cell-derived progenitors were absent in human CPM cases, which may have contributed to the inefficient lesion repair. The present study points to the importance of astrocyte-oligodendrocyte interactions for remyelination, highlighting the necessity to further determine the impact of astrocyte dysfunction on remyelination inefficiency in demyelinating disorders including MS

Generierung eines Mausmodells für „ICE-Fieber“

Fragestellung: Um die Auswirkungen von genetischen Varianten für CASP1 in vivo analysieren zu können, sollte in dieser Arbeit ein Tiermodell generiert werden. Dadurch könnten die zugrundeliegenden Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten in einem gesamten Organismus aufgeklärt werden, da die Untersuchung von Patientenmaterial nur sehr eingeschränkt möglich ist. Ein Mausmodell stellt eine der besten Alternativen zur Analyse von Primärmaterial dar, da die Immunsysteme von Maus und Mensch sehr ähnlich sind. Ergebnisse: Um die natürliche Expression und Regulation der Procaspase-1 im Mausmodell zu gewährleisten, wurde für die Generierung ein BAC-Transgen verwendet. Mittels homologer Rekombination wurde die künstliche Variante C284A von Casp1 inseriert. Diese führt zu einer Zerstörung des enzymatischen Zentrums der Caspase-1 und zum vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Nach zwei Pronukleusinjektionen konnten lediglich drei Gründertiere mit mosaikartiger Expression des zufällig im Genom integrierten Transgens Casp1C284A und in der F1-Generation nur ein Tier mit stabil integriertem Transgen identifiziert werden. Die Nachkommen dieses transgenen Tieres zeigten keine basale Expression von Casp1C284A, jedoch konnte nach Stimulation von BMDCs mit LPS in vitro die Expression sowohl auf RNA- wie auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Ebenfalls eine erhöhte Sekretion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 wurde in den Zellen der transgenen Tiere detektiert. Gleichfalls konnte nach Stimulation mit LPS in vivo eine gesteigerte Entzündungsreaktion in den Tieren mit Casp1C284A gezeigt werden, da ein stärkerer und länger anhaltender Abfall der peripheren Körpertemperatur und außerdem eine gesteigerte Sekretion von TNF-α und IL-6 zu verzeichnen war. Eine gesteigerte Inflammation des fetalen Gewebes, ausgelöst durch die integrierte künstliche Variante der Procaspase-1, könnte die Frage nach der geringen Anzahl der generierten Gründertiere beantworten. Hierfür wurde weiterführend eine Maus mit einem konditionalen Casp1C284A-Konstrukts generiert, welches zusätzlich eine zeit- als auch zelltyp-spezifische Expression der Procaspase-1 mit zentraler Mutation ermöglicht. Nach erfolgreichem Screening der ES-Zellen konnten diese in Blastozysten mikroinjiziert und Chimäre identifiziert werden. Eine embryonale Letalität des transgenen Konstrukts konnte durch die Verpaarung der ki-Tiere R26_Casp1C284A mit PGK-Cre-Tieren, die Cre-Rekombinase ubiquitär exprimieren, nahezu ausgeschlossen werden, da die Nachkommen alle lebensfähig waren und eine basale Expression des „knock-ins“ in mehreren Organen und auch in BMDCs nachgewiesen wurde. Ferner konnte nach Induktion einer Inflammation in vivo mit einer subletalen Dosis von LPS ein gesteigerter und länger anhaltender peripherer Temperaturabfall in den ki-Tieren ähnlich zu den transgenen Tieren detektiert werden. Desgleichen wurde eine Tendenz zu einer gesteigerten Sekretion der Zytokine TNF-α und IL-6 verzeichnet. Schlussfolgerungen: Mit dem transgenen Casp1C284A-Mausmodell als auch mit dem konditionalen R26_Casp1C284A-Modell konnte gezeigt weren, dass eine inaktive Variante der Procaspase-1 zur Entstehung einer gesteigerten Inflammation in einem gesamten Organismus führen kann. Somit können die im Rahmen dieser Arbeit generierten Tiermodelle zur Analyse der Pathomechanismen der an „ICE-Fieber“ leidenden Patienten herangezogen werden. In künftigen Studien kann ferner geklärt werden, ob die Entzündungsreaktionen durch eine verstärkte Interaktion von Casp1C284A mit der Kinase RIP2 verursacht werden und dadurch ähnlich wie im Patienten eine Aktivierung des proinflammatorischen Moleküls NFκB ausgelöst wird. Im Anschluss könnte eine spezifische Inhibierung des RIP2-Signalweges in diesen Mausmodellen getestet werden und schließlich im Patienten Anwendung finden. Die in dieser Arbeit generierten Mausmodelle könnten somit zur Erprobung zukünftiger therapeutischer Konzepte dienen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. TabellenverzeichnisProblem: In order to recapitulate the effects of the CASP1 variants found in the patients a mouse model should be generated. The analysis of material from the patients unfortunately is very restricted and therefore the generation of a mouse model represents the best alternative to see if the in vitro hypothesis of the IFG group really applies to an in vivo situation. Results: To generate a transgenic mouse model the artificial variant Casp1C284A was inserted into a BAC to enable a natural expression and regulation of Casp1C284A. This mutation results in a disruption of the active centre and to a complete loss of the enzymatical activity of caspase-1. After two pronuclei injections we received 180 pubs of TG mice. Only three of them harboured transgenic sequences and only one animal in the F1 generation harboured the complete Casp1C284A sequence. Expression analyses of the offspring of this mouse revealed no basal transcriptional expression of the transgene. Hence, protein expression could not be detected in unstimulated cells. However, stimulation with LPS upregulated transcription and low-level translation of Casp1C284A in BMDCs and an elevated secretion of the proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 was detected as well. Likewise, after in vivo stimulation of transgenic mice with LPS i.p. the drop of body temperature was significantly enhanced in comparison to the control mice. And also the level of the proinflammatory cytokines was increased. Furthermore, a conditional R26_Casp1C284A construct allowing a temporal or a celltype specific expression of the caspase-1 with the central mutation was generated. Positive screened ES cell clones were injected into blastocysts and thereafter chimera could be identified. An embryonic lethality due to the integration of the enzymatically inactive caspase-1 could be excluded by the crossing with ubiquitious expressing PGK-Cre mice. All the corresponding mice were alive and a basal transcriptional as well translational expression was demonstrated. Concordantly with the results of the transgenic mice the conditional R26_Casp1C284A mice showed an enhanced drop of the body temperature in comparison to control mice after stimulation with sublethal dose of LPS in vivo. Likewise, a trend to an elevated secretion of TNF-α and IL-6 was observed. Conclusion: With the generated transgenic Casp1C284A as well as the conditional R26_Casp1C284A animal models we showed that an inactive variant of the procaspase-1 could result in a proinflammatory cytokine response and a development of an increased inflammation of a whole organism. Thus, these data support the previous postulated model of the IFG group for proinflammatory effects induced by variants of procaspase-1 with reduced enzymatic activity. Hence, the mouse models established in this work are suited for further analysis of the pathomechanism in the patients with ICE fever. For instance the cellular mechanism could be examined if the inflammation is provoked by an increased interaction of the mutated procaspase-1 with the kinase RIP2 and therefore the NFκB activation is increased, respectively. Also a further medicinal inhibition of the RIP2 signaling or other therapeutic testings in this mouse models are conceivable.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das angeborene und adaptive Immunsystem 1.2 Sensoren des angeborenen Immunsystems 1.2.1 Membran-gebundene Rezeptoren 1.2.2 Intrazelluläre PRRS 1.2.3 Inflammasome als Multiproteinkomplexe 1.2.4 Das NLRP3-Inflammasom 1.2.5 Metabolische Krankheiten, die mit Inflammasom-Aktivität assoziiert werden 1.2.6 Inflammasom-assoziierte autoinflammatorische Erkrankungen 1.2.6.1 Das Cryoporin-assoziierte periodische Syndrom (CAPS) 1.2.6.2 Familian Mediterranean Fever (FMF) 1.2.6.3 Pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne syndrome (PAPA) 1.3 Caspase-1 1.3.1 Caspasen im Allgemeinen 1.3.2 Der Caspase-1 Gen-Lokus und das Caspase-1 Gen 1.3.3 Das Caspase-1 Protein 1.3.4 Funktionen von Caspase-1 1.3.4.1 Prozessierung der Zytokine pro-IL-1ß und pro-IL-18 1.3.4.2 Induktion von Pyroptose 1.3.4.3 Aktivierung der Caspase-1 durch ER-Stress 1.3.4.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB 1.3.4.5 weitere Funktionen 1.3.5 Caspase-1 Genvarianten und Entzündung 1.4 Mausmodelle 1.4.1 NLRP3 1.4.2 Pyrin 1.4.3 Caspase-1 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Antibiotika 3.1.2 Antikörper 3.1.3 Bakterienstämme 3.1.4 BAC-Klon 3.1.5 Plasmide 3.1.6 Zelllinie 3.1.7 Chemikalien und Substanzen 3.1.8 Enzyme 3.1.9 Größenstandards 3.1.10 Oligonukleotide 3.1.11 Kommerzielle Kits 3.1.12 Puffer und Lösungen 3.1.13 Mauslinien 3.1.14 Medien 3.1.15 Geräte 3.1.16 Software 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Agarosegelelektrophorese 3.2.2 Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion 3.2.3 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 3.2.4 Aufreinigung von BAC-DNA mittels Elektroelution 3.2.5 Aufreinigung von Subklon-Plasmid-DNA für die Elektroporation von ES-Zellen 3.2.6 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit von DNA und RNA 3.2.7 c-DNA-Synthese 3.2.8 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatresten 3.2.9 DNA-Isolierung 3.2.9.1 DNA-Isolierung aus Bakterienzellen 3.2.9.2 DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen 3.2.10 DNA-Sequenzierung 3.2.11 Enzymatische Restriktionsspaltung von DNA-Fragmenten 3.2.12 Homologe Rekombination von DNA-Sequenzen 3.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten mit linearisierten Vektoren 3.2.14 Phenol-Chloroform-Extraktion 3.2.15 Pulsfeldgelelektrophorese 3.2.16 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 3.2.17 RNA-Isolation aus eukaryotischen Zellen und Geweben 3.2.18 Southern Blot 3.3 Mikrobiologische Methoden 3.3.1 Kultivierung von Bakterien 3.3.2 Hitzschock-Transformation von E.coli 3.3.3 Kryokonservierung 3.4 Proteinbiochemische Methoden 3.4.1 CBA (cytokine bead assay) 3.4.2 Proteinbestimmung 3.4.3 Immunpräzipitation mit Caspase-1 p10 (M-20) Antikörper von Santa Cruz 3.4.4 Immunpräzipitation mit AntiFlag M2 Affinity Gel von Sigma 3.4.5 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.4.6 Western Blot 3.4.7 Immunchemische Detektion von Proteinen 3.5 Zellbiologische Methoden 3.5.1 Bestimmung der Zellzahl 3.5.2 Isolierung und Generierung von BMDCs 3.5.3 Kryokonservierung von Zellen 3.5.4 Kultivierung von Zelllinien 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Genotypisierung 3.6.2 Haltung 3.6.3 Hautbiopsie 3.6.4 Retroorbitale Blutentnahme und Herzpunktion 3.6.5 Injektion von LPS 3.6.6 Organentnahme 4 Ergebnisse 4.1 Generierung eines Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.1 Identifikation und Verifizierung des BAC-Klons 4.1.2 Klonierung des Casp1C284A-BAC-Transgens 4.1.2.1 Entfernung der wt-loxP-Stelle vom Vektorrückrat 4.1.2.2 Insertion eines Flag-Tags 4.1.2.3 Einführung der Punktmutation C284A 4.1.3 „Shaving“ des generierten Casp1C284A-BAC-Konstrukts 4.1.4 Aufreinigung des Casp1C284A-BAC-Konstrukts und Pronukleusinjektion 4.1.5 Genotypisierung der transgenen Casp1C284A Gründertiere 4.2 Charakterisierung der transgenen Casp1C284A-Tiere (tg) 4.2.1 In vitro-Stimulation von BMDCs mit LPS 4.2.2 In vivo-Stimulation der transgenen Casp1C284A-Tiere 4.3 Generierung eines konditionalen Casp1C284A-Konstrukts 4.3.1 Klonierung des Targetingvektors pSerc_Casp1C284A_Flag und des Kontroll-Targetingvektors pSerc_Casp1_Flag 4.3.2 Screening von ES-Zellen 4.3.3 Genotypisierung der Chimäre und Verpaarung mit PGK-Cre Tieren 4.3.4 Expressionsanalyse der R26_Casp1C284A del-Tiere 4.3.5 In vivo-Stimulation der R26_Casp1C284A del-Tiere 5 Diskussion 5.1 Entwurf eines Mausmodells für ICE-Fieber 5.2 Konstruktion des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.3 Identifizierung von Casp1C284A-transgenen Tieren 5.4 Funktionelle Analyse des Casp1C284A-BAC-Transgens 5.5 Konstruktion des konditionalen Mausmodells R26_Casp1C284A 5.6 Aktivierung des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A durch Cre-mediierte Rekombination in vivo 5.7 Funktionelle Analyse des ki-Mausmodells R26_Casp1C284A 5.8 Relevanz eines Mausmodells für den Patienten 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang A. Abbildungsverzeichnis B. Tabellenverzeichni

Contribution of Veillonella parvula to Pseudomonas aeruginosa-mediated pathogenicity in a murine tumor model system.

The recent finding that high numbers of strict anaerobes are present in the respiratory tract of cystic fibrosis (CF) patients has drawn attention to the pathogenic contribution of the CF microbiome to airway disease. In this study, we investigated the specific interactions of the most dominant bacterial CF pathogen, Pseudomonas aeruginosa, with the anaerobic bacterium Veillonella parvula, which has been recovered at comparable cell numbers from the respiratory tract of CF patients. In addition to growth competition experiments, transcriptional profiling, and analyses of biofilm formation by in vitro studies, we used our recently established in vivo murine tumor model to investigate mutual influences of the two pathogens during a biofilm-associated infection process. We found that P. aeruginosa and V. parvula colonized distinct niches within the tumor. Interestingly, significantly higher cell numbers of P. aeruginosa could be recovered from the tumor tissue when mice were coinfected with both bacterial species than when mice were monoinfected with P. aeruginosa. Concordantly, the results of in vivo transcriptional profiling implied that the presence of V. parvula supports P. aeruginosa growth at the site of infection in the host, and the higher P. aeruginosa load correlated with clinical deterioration of the host. Although many challenges must be overcome to dissect the specific interactions of coinfecting bacteria during an infection process, our findings exemplarily demonstrate that the complex interrelations between coinfecting microorganisms and the immune responses determine clinical outcome to a much greater extent than previously anticipated

Lack of astrocytes hinders parenchymal oligodendrocyte precursor cells from reaching a myelinating state in osmolyte-induced demyelination

Demyelinated lesions in human pons observed after osmotic shifts in serum have been referred to as central pontine myelinolysis (CPM). Astrocytic damage, which is prominent in neuroinflammatory diseases like neuromyelitis optica (NMO) and multiple sclerosis (MS), is considered the primary event during formation of CPM lesions. Although more data on the effects of astrocyte-derived factors on oligodendrocyte precursor cells (OPCs) and remyelination are emerging, still little is known about remyelination of lesions with primary astrocytic loss. In autopsy tissue from patients with CPM as well as in an experimental model, we were able to characterize OPC activation and differentiation. Injections of the thymidine-analogue BrdU traced the maturation of OPCs activated in early astrocyte-depleted lesions. We observed rapid activation of the parenchymal NG

Non-canonical Caspase-1 signaling drives RIP2-dependent and TNF-α-mediated inflammation in vivo

Pro-inflammatory caspase-1 is a key player in innate immunity. Caspase-1 processes interleukin (IL)-1β and IL-18 to their mature forms and triggers pyroptosis. These caspase-1 functions are linked to its enzymatic activity. However, loss-of-function missense mutations in CASP1 do not prevent autoinflammation in patients, despite decreased IL-1β production. In vitro data suggest that enzymatically inactive caspase-1 drives inflammation via enhanced nuclear factor κB (NF-κB) activation, independent of IL-1β processing. Here, we report two mouse models of enzymatically inactive caspase-1-C284A, demonstrating the relevance of this pathway in vivo. In contrast to Casp1 mice, caspase-1-C284A mice show pronounced hypothermia and increased levels of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and IL-6 when challenged with lipopolysaccharide (LPS). Caspase-1-C284A signaling is RIP2 dependent and mediated by TNF-α but independent of the NLRP3 inflammasome. LPS-stimulated whole blood from patients carrying loss-of-function missense mutations in CASP1 secretes higher amounts of TNF-α. Taken together, these results reveal non-canonical caspase-1 signaling in vivo.Reinke et al. show that enzymatically inactive caspase-1-C284A mediates non-canonical caspase-1 signaling. This pathway is RIP2 dependent and mediated by TNF-α but independent from IL-1 cytokines