Collision energies on QTof and Orbitrap instruments: How to make proteomics measurements comparable?

QTof CID and Orbitrap HCD are the most commonly used fragmentation techniques in mass spectrometry based proteomics workflows. The information content of the MS/MS spectra is first and foremost determined by the applied collision energy. How can we set up the two instrument types to achieve maximum transferability? To answer this question, we compared MS/MS spectra obtained on a Bruker QTof CID and a Thermo Q-Exactive Focus Orbitrap HCD instrument as a function of collision energy using the similarity index. Results show that with a few eV lower collision energy setting on HCD (Orbitrap-specific CID) than on QTof CID, nearly identical MS/MS spectra can be obtained for leucine enkephalin pentapeptide standard, for selected +2 and +3 enolase tryptic peptides and for a large number of peptides in a HeLa protein digest. The Bruker QTof was able to produce colder ions, which may be significant to study inherently labile compounds. Further, we examined energy dependence of peptide identification confidence, as characterized by Mascot scores, on the HeLa peptides. In line with earlier QTof results, this dependence shows one or two maxima (unimodal or bimodal behavior) on Orbitrap. The fraction of bimodal peptides is lower on Orbitrap. Optimal energies as a function of m/z show a similar linear trend on both instruments, which suggests that with appropriate collision energy adjustment, matching conditions for proteomics can be achieved. Data has been deposited in the MassIVE repository (MSV000086434)

Cell-penetrating conjugates of pentaglutamylated methotrexate as potential anticancer drugs against resistant tumor cells

The emerging resistance of tumor cells against methotrexate (MTX) is one of the major limitations of the MTX treatment of tumorous diseases. The disturbance in the polyglutamation which is a main step in the mechanism of methotrexate action is often the reason of the resistance. Delivery of polyglutamylated MTX into cells may evade the mechanisms that are responsible for drug resistance. In this study conjugates of methotrexate and its pentaglutamylated derivatives with cell-penetrating peptides – penetratin and octaarginine – were investigated. The cellular-uptake and in vitro cytostatic activity of conjugates were examined on breast cancer cell cultures (MDA-MB-231 as resistant and MCF-7 as sensitive cell culture). These cell cultures showed very different behaviour towards the conjugates. Although the presence of pentaglutamyl moiety significantly decreased the internalisation of conjugates, some of them were significantly active in vitro. All of the conjugates were able to penetrate in some extent into both cell types, but only the conjugates of penetratin showed in vitro cytostatic activity. The most effective conjugates were the MTX-Glu5-Penetratin(desMet) and MTX-Glu5-GFLG-Penetratin(desMet). The latter was effective on both cell cultures while the former was active only on the resistant tumor cells. Our results suggest that the translocation of polyglutamylated MTX may be a new way to treat sensitive and more importantly resistant tumors. While both penetratin and octaarginine peptides were successfully used to deliver several kinds of cargos earlier in our case the activity of penetratin conjugates was more pronounced

Célzott terápiára alkalmas új peptidkonjugátumok szintézise és alkalmazása rosszindulatú daganatok kezelésében. = Development of new peptide conjugates for targeted therapy of cancer.

Célunk az volt, hogy olyan hatóanyag szállító rendszereket állítsunk elő, amelyek a tumornövekedést gátló hatóanyagokat szelektíven juttatják a tumoros sejtekbe. Ennek érdekében előállítottunk több mint 70 vegyületet, ezen belül kb. 50 GnRH illetve oligotuftsin hordozó – hatóanyag konjugátumot. Vizsgáltuk a konjugátumok in vitro tumorellenes hatását, sejtbe jutásukat, enzim stabilitásukat, metabolizmusukat és a metabolitok DNS kötődését. Összehasonlítottuk néhány vegyület receptorkötődési képességét. Szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatával megállapítottuk, hogy milyen szekvencia módosítások, peptid-hatóanyag közötti kötéstípusok (pl. oxim, észter, hidrazon,) eredményeznek hatékonyabb konjugátumokat. A tumorellenes hatást több hatóanyag sejtbe juttatásával is fokozni kívántuk. Ezért a konjugátumok dimerjeit, illetve több drog molekulát tartalmazó konjugátumot is előállítottunk. Vizsgáltuk a vegyületek kemotaxisát és sejtadhézióra gyakorolt hatását, amelyek fontosak a tumor metasztázisában. Az vizsgálatok megkönnyítése érdekében saját fejlesztésű kemotaxis chippet készítettünk. A tumorsejtekben kezelés hatására lejátszódó, fehérje és RNS szintű változások tanulmányozására proteomikai és RT-PCR módszereket alkalmaztunk. A kutatás adott fázisában az aktuálisan leghatékonyabb vegyületek in vivo tumorellenes hatását vizsgáltuk vastagbél tumorral beoltott egereken. Az eredményekből olyan következtetéseket vontunk le, amelyek jelentősek a további kísérletek szempontjából. | The aim of our project was the development of drug delivery systems that target anticancer drugs selectively to the tumor cells. For this purpose more than 70 new compounds, among them ca. 50 GnRH and oligotuftsin based carrier – drug conjugates, were prepared. In vitro antitumor activity, cellular uptake, enzyme stability and metabolism of the conjugates were studied. The DNA binding of the metabolites was also investigated. The receptor binding activity of several compounds was checked and compared. The structure – activity relationship studies showed the allowed substitutions in the peptide sequences. The influence of types of bond (e.g. oxime, ester, hydrazone) between the drug and carrier molecule on efficient drug release was identified. The antitumor activity of the compounds could be increased by the elevation of drug molecules (identical or different) on carrier molecules or by dimerization of the drug containing monomer conjugates. For the development of metastasis preventing compounds the chemotactic activity of the conjugates and their influence on cell adhesion were also studied. For these studies new chemotactic chips were developed. The protein or RNA based changes in the treated cells compared to untreated cells were studied by proteome analysis or by RT-PCR. The best compounds were selected for in vivo studies. The antitumor activity of the compounds was measured on colon cancer bearing mice. The results of the project are useful for the further research

Urogenitalis lokalizációjú mucosamelanoma primer és áttétes esetei klinikánkon = Mucosal melanoma primary and metastatic cases with urogenital localization in our department

Absztrakt: Bevezetés: Az urogenitalis lokalizációban előforduló mucosamelanomáknak mind a primer, mind az áttétes esetei ritka daganatok. A primer melanomás esetek mindössze 4–5%-a extracutan eredetű, melyek általában későn kerülnek felismerésre, ezért prognózisuk rossz. Betegek és módszer: Intézetünkben az elmúlt években húgy-ivar szervi melanomát 7 esetben észleltünk. Egy amelanoticus húgycső, egy húgyhólyag, két hímvessző melanomás esetet és három metasztatikus daganatot. A megjelenésről, a kezelésről és a klinikai kimenetelről rendelkezésre álló adatokat retrospektív módon értékeltük. Eredmények: Három inoperábilis áttétes esetben palliatív, urológiai-sebészeti beavatkozás és szisztémás daganatellenes terápia történt. Négy primer urogenitalis tumorból kettő lokalizálódott a péniszre. Az egyik esetben helyi recidíva alakult ki műtéti ellátás után, azonban radikális, ismételt műtéttel a beteg másfél éve tünetmentes. A másik, igen elhanyagolt hímvessző-melanoma radikális műtét és inguinalis blokkdissectio után két évvel disszeminálódott. A nőbeteg primer húgycsőmelanomájánál az első szövettani vizsgálat primer mesenchymalis tumort írt le, a másfél évvel később kialakult recidív tumorból igazolódott a melanoma diagnózisa. A húgycsőérintettség miatt elvégzett radikális műtét 5 év tünetmentességet eredményezett, ezt követően alakult ki helyi recidíva és távoli áttét. A negyedik, először primer húgyhólyag eredetű melanomának tartott esetben a rapid progressziót mutató kórlefolyás és a tumor BRAF-pozitivitása alapján felmerült, hogy nem az elsőként húgyhólyagban diagnosztizált melanoma volt a primer tumor. Következtetés: A húgy-ivar szervi melanoma előfordulása igen ritka. Felfedezése sokszor már disszeminált állapotban történik, ezért az esetek várható prognózisa is rossz. A terápiás hatékonyságot növelő legfontosabb tényezők a korai diagnózis és a radikális műtéti beavatkozás. A cutan melanomához képest prognózisuk rosszabb, aminek hátterében a klinikai és patológiai diagnosztikus nehézség állhat. A legújabb célzott és immunterápiás szerek az áttétes betegek túlélését lényegesen javíthatják. Orv Hetil. 2019; 160(10): 378–385. | Abstract: Introduction: Both primary and metastatic cases of mucosal melanoma in urogenital localization are rare tumors. Only 4–5% of all primary melanomas do not arise from the skin. Extracutaneous melanomas have a complex clinical presentation, but these aggressive tumors have a poor prognosis. Materials and method: In our department, we found 7 patients with malignant melanoma of the genitourinary tract in the past few years. The 7 cases were: primary amelanotic melanoma of the female urethra, a primary melanoma of the bladder, two primary melanomas of the penis, a metastatic melanoma of the urethra and another to the testis and a metastatic melanoma of the bladder with melanuria. We retrospectively analyzed the available data to describe the presentation, management, and clinical outcome of the patients. Results: In the three inoperative cases, palliative, urologic surgical procedures and systemic antitumor therapy were performed. Two of the four primary urogenital tumors were localized to the penis. In one case, local recurrence developed after surgical treatment, but with a radical, repeated surgery, the patient has been asymptomatic for a year and a half. In the other, neglected case, the penis melanoma spread through the urethra and the inguinal lymph nodes two years after radical surgery and inguinal block dissection. In the female primary urethral melanoma case, the first histological study reported a primary mesenchymal tumor, and the recurrent tumor that occurred one and a half years later showed melanoma diagnosis. Radical surgery performed because of urethral involvement resulted in a 5-year asymptomatic state, followed by local recurrence and distant metastasis. In the fourth case of a primary bladder melanoma, the rapid progression of the disease and the BRAF positivity of the tumor suggested that not the firstly diagnosed bladder melanoma was the primary tumor. Conclusion: The occurrence of urinary tract melanoma is very rare and its discovery happens often in a disseminated state, so the expected prognosis of the cases is also poor. The most important factors for increasing therapeutic efficacy are early diagnosis and radical surgical intervention. Tumors appearing in different localizations require different urological surgical approaches. The literature recommendations for treatment are not uniform. Their prognosis is worse compared to the cutaneous melanoma, which may be due to clinical and pathological diagnostic difficulties. The latest targeted and immunotherapeutic agents can significantly improve the survival of metastatic patients. Orv Hetil. 2019; 160(10): 378–385

Sequence modification of heptapeptide selected by phage display as homing device for HT-29 colon cancer cells to improve the anti-tumour activity of drug delivery systems

Development of peptide-based conjugates for targeted tumour therapy is a current research topic providing new possibilities in cancer treatment. In this study, VHLGYAT heptapeptide selected by phage display technique for HT-29 human colon cancer was investigated as homing peptide for drug delivery. Daunomycin was conjugated to the N-terminus of the peptide directly or through Cathepsin B cleavable spacers. Conjugates showed moderate in vitro cytostatic effect. Therefore, sequence modifications were performed by Ala-scan and positional scanning resulting in conjugates with much higher bioactivity. Conjugates in which Gly was replaced by amino acids with bulky apolaric side chains provided the best efficacy. The influence of the cellular uptake, stability and drug release on the anti-tumour activity was investigated. It was found that mainly the difference in the cellular uptake of the conjugates generated the distinct effect on cell viability. One of the most efficient conjugate Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2 showed tumour growth inhibition on orthotopically developed HT-29 colon cancer in mice with negligible toxic side effect compared to the free drug. We also indicate that this sequence is not specific to HT-29 cells, but it has a remarkable effect on many other cancer cells. Nevertheless, the Phe-containing conjugate was more active in all cases compared to the conjugate with the parent sequence. The literature data suggested that this sequence is highly overlapped with peptides that recognize Hsp70 membrane bound protein overexpressed in many types of tumours

Diversity of Sediment Bacterial Communities and their Role in the Phosphorus Cycle in Lake Balaton and Soda Lakes of Kiskunság

A üledékfelszíni baktériumközösségek kulcsszerepet töltenek be a szerves anyagok lebontásában, és nagymértékben befolyásolhatják a belső tápanyag-terhelést a természetes vízi ökoszisztémákban. Az üledéklakó mikrobaközösségek összetételéről, aktivitásáról és szezonális dinamikájáról azonban máig kevés információval rendelkezünk. Munkámat két hipertróf kiskunsági szikes kistavon (Kelemen-szék és Böddi-szék) és a Balaton mezotróf Siófoki- és eutróf Keszthelyi-medencéjében végeztem. Célom az üledékfelszíni baktériumközösségek aktivitásának, szerkezetének, az aerob kemoorganotróf szervezetek csíraszámának, faji hovatartozásának és funkcionális szerepének megismerése volt, különös tekintettel a baktériumok foszforforgalmi szerepére. A hipertróf szikes kistavak üledékében az aerob kemoorganotróf baktériumok csíraszám értékei nagyságrendileg nagyobbak voltak, mint a Balaton két medencéjében. A Kelemen-székben és a Böddi-székben a csíraszám értékek szezonálisan kevéssé változtak. A Balaton esetében kemoorganotróf baktériumok telepszáma nagyobb volt az eutróf, mint a mezotróf medence üledékében. Ősszel Keszthely és Tihany térségében is kisebb telepszámokat kaptunk, nagy valószínűséggel a hőmérséklet csökkenése miatt. A közösségi szintű szénforrás hasznosítási vizsgálat (BIOLOG) eredményei alapján a kiskunsági szikes kistavakban a mikrobaközösségek metabolikus aktivitását a csökkenő hőmérséklet és a növekvő szalinitás is negatívan befolyásolta. A Siófoki- és Keszthelyi-medence bentikus mikrobaközösségeinek metabolikus profilja a mintavételi időpontok szerint csoportosult. A tenyésztéstől független diverzitás vizsgálat (denaturáló gradiens gélelektroforézis) eredményei alapján, ősszel a két szikes kistó, valamint a Balaton esetében a Siófoki- és a Keszthelyi-medence üledékfelszíni baktériumközösségeinek filogenetikai szerkezete hasonló volt egymáshoz. Tavasszal és nyáron a mintavételi területeket jellemző eltérő környezeti feltételek – a szikes vízterekben elsősorban a sótartalom, a Balatonban az eltérő trofitás – hatása jobban érvényesült, ezáltal az üledékfelszíni mikrobaközösségek szerkezete elkülönült egymástól. Tenyésztésen alapuló módszerrel a kiskunsági kistavak üledékében főként sós szikes élőhelyekre jellemző alkalofil vagy alkalitoleráns és halotoleráns vagy halofil fajokkal rokon szervezetek, míg a Balatonban főleg édesvízi ökoszisztémákban gyakori, neutrofil fajok jelenlétét igazoltuk. A Balaton üledékéből közel kétszer annyi (összesen 63) fajt mutattunk ki, mint a szikes kistavakból (összesen 35). A hipertróf szikes vízterekből származó tenyészetek a szerves foszforvegyületeket kisebb arányban értékesítették, mint a foszfor limitált balatoni szervezetek. Mindkét mintavételi területen a baktériumtörzsek többsége polifoszfátot halmozott fel. A polifoszfátraktározás a szikes kistavakban a különleges környezeti feltételekhez (pH és sótartalom) való alkalmazkodást segítheti, a balatoni szervezetek számára elsősorban foszforraktárként szolgálhat. Eredményeink alapján a polifoszfát-felhalmozás képessége a különböző filogenetikai csoportokba (Firmicutes, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria) tartozó baktériumtörzsekre egyaránt jellemző, de nemzetségeken belül, az egyes baktériumfajokba tartozó szervezetek polifoszfátot felhalmozó képessége jelentősen különbözhet. Microbially-mediated biogeochemical transformations at the sediment-water interface have strong effect on biochemical cycling of the elements and influence largely the nutrient availability in the overlying waters. Yet little is known about the spatial and temporal variability of density, activity and composition of sediment bacterial communities in aquatic environments. I focused my research on sediment bacterial communities of two soda lakes located in Kiskunság National Park (Kelemen-szék and Böddi-szék) and two basins of Lake Balaton (mesotrophic Siófok basin and eutrophic Keszthely basin). The abundance of cultivable aerobic chemo-organotrophic bacteria was the highest in the hypertrophic soda lakes and the lowest in the mesotrophic Siófok basin. Seasonal changes in colony counts were not characteristic in soda lakes. Abundance of cultivable aerobic chemo-organotrophic bacteria significantly differed between two basins exhibiting different trophic conditions in Lake Balaton in each season. The lowest viable counts were observed in autumn and the highest in spring and summer months in both basins, which showed that decreasing temperature had strong effect on benthic bacterial abundance in Lake Balaton. Carbon source utilization patterns of microbial communities were investigated using BIOLOG microplates. Microbial activity was affected negatively by declining temperature and increasing conductivity in soda lakes. On the basis of their metabolic profile microbial communities of Siófok and Keszthely basin grouped according to the sampling dates. Cultivation independent analysis (denaturing gradient gel electrophoresis) revealed that phylogenetic structure sediment bacterial communities of the two soda lakes and the two basins of Lake Balaton were similar in autumn and could be distinguished in spring and summer months. Thus the temperature had strong effect on sediment bacterial diversity and site specific environmental factors – like contrasting conductivity and trophy – resulted distinctive community structure in warm periods. Presence of aerobic, chemo-organotrophic species adapted to saline and/or alkaline habitats (alkalitolerant or alkaliphilic and halotolerant or halophilic species) was proven with cultivation dependent methods of the soda lakes. Most of the strains isolated from Lake Balaton were identified as closest relatives of neutrophilic species. Almost two times more species were identified from Lake Balaton (63 species) than from the sediment of soda lakes (35 species). Characteristically lower rates of strains hydrolyzed the organic phosphorus compound in the case of the hypertrophic soda lakes than in the case of Lake Balaton. Polyphosphate probably helps in the adaption of sediment bacteria to the special environmental conditions (pH and salinity) featuring the soda lakes. Excess polyphosphate accumulation may serve as phosphorus storage for sediment bacteria in Lake Balaton. Our study implied that polyphosphate accumulation is widespread among the members of Firmicutes, Actinobacteria, Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria; and phosphorus metabolism of species related to a single genus can vary remarkably